細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)(黃建華)

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1、第四章細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)解放軍總醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所免疫學(xué)研究室黃建華細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)平臺基因治療基因診斷試管嬰兒組織工程藥物篩選致病機(jī)理主要內(nèi)容基本操作技術(shù)和要求原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)和細(xì)胞系的維持細(xì)胞凍存與復(fù)蘇細(xì)胞培養(yǎng)污染的檢測和排除細(xì)胞是生命活動的基本單位1665年英國學(xué)者RobertHooke，用自制的顯微鏡觀察軟木的薄片，第一次發(fā)現(xiàn)植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并首次借用拉丁文Cella（小室）詞.1983-39德國植物學(xué)家施萊登和動物學(xué)家施旺確立了“細(xì)胞學(xué)說”的基本原則。（１）細(xì)胞是有機(jī)體，動植物都是由細(xì)胞發(fā)

2、育來的；（２）每個細(xì)胞都作為一個相對的獨(dú)立單位，有自己的“生命”。（３）新的細(xì)胞可以通過老的細(xì)胞繁殖產(chǎn)生。進(jìn)化論，遺傳學(xué)和細(xì)胞學(xué)說定為現(xiàn)代生物學(xué)的三大基石，而細(xì)胞學(xué)說又是后二者的"基石"。組織（細(xì)胞）培養(yǎng)從生物體內(nèi)取出細(xì)胞（組織），模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度和一定營養(yǎng)條件下，使之生存、生長并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。細(xì)胞（組織），包括器官培養(yǎng)終歸是離體培養(yǎng)，缺少生物整體的嚴(yán)密聯(lián)系，不能代表整個機(jī)體。在進(jìn)行醫(yī)學(xué)生物實(shí)驗過程及對結(jié)果的評估是都必須考慮這些。1基本操作技術(shù)和要求由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞

3、沒有抗感染能力，因此防污染是決定培養(yǎng)成功的首要條件。一切操作需要保證無菌和有條不紊。1.1培養(yǎng)室內(nèi)的無菌技術(shù)培養(yǎng)前的準(zhǔn)備：按實(shí)驗計劃和程序準(zhǔn)備物品，作到心中有數(shù)培養(yǎng)室和超凈臺：定期全面徹底消毒培養(yǎng)用品的無菌處理：高壓滅菌、過濾、酒精消毒實(shí)驗中無菌培養(yǎng)操作：均在火焰近處進(jìn)行，實(shí)驗用品需火焰滅菌，冷卻后接觸培養(yǎng)細(xì)胞，以防燒死細(xì)胞。1.2培養(yǎng)細(xì)胞的取材基本要求：取材組織用培養(yǎng)液浸泡，4度運(yùn)送，24h內(nèi)盡快培養(yǎng)。取材無菌操作，避免對組織的機(jī)械損傷，盡量去除脂肪、神經(jīng)、結(jié)締、壞死組織，污染組織可用青鏈霉素

4、和制霉菌素漂洗。原代取材同時保留組織學(xué)和電鏡標(biāo)本，對供體來源、部位及一般情況做記錄。1.2.3皮膚和粘膜的取材皮膚和粘膜是上皮細(xì)胞培養(yǎng)的重要來源。取材方法似斷層皮片手術(shù)，面積2-3mm2.盡可能去除皮下和粘膜下組織。因分布在體表，故細(xì)菌、霉菌很多，需嚴(yán)格消毒，可用較高濃度抗菌素漂洗。1.2.4內(nèi)臟和實(shí)體瘤的取材內(nèi)臟除消化道和泌尿管道外基本是無菌的，明確取材部位，去除結(jié)締組織。腫瘤組織取材避免壞死液化和結(jié)締組織，標(biāo)本應(yīng)按污染組織處理。1.2.5血細(xì)胞的取材血細(xì)胞培養(yǎng)可用于造血干細(xì)胞移植、免疫活性細(xì)

5、胞的治療和染色體分析等。取血抗凝劑量過大易導(dǎo)致溶血，肝素常用濃度為20U/ml,針管用較高濃度肝素500U/ml濕潤。1.3組織材料的分離欲從組織中獲得大量生長良好的細(xì)胞，須將組織分散開，使細(xì)胞解離出來。常用方法有機(jī)械法和化學(xué)法。1.3.1細(xì)胞懸液的分離方法離心法：血液和體液等細(xì)胞懸液500-1000rpm轉(zhuǎn)速5-10分鐘。離心速度過大、時間過長，會造成細(xì)胞損傷和死亡。密度梯度離心法：用離心法將細(xì)胞分到不同密度的梯度介質(zhì)中，再分別吸出各層細(xì)胞。適于分離密度不等的的細(xì)胞。常用介質(zhì)有Ficoll40

6、0,Percoll,泛影葡胺等。。1.3.2.1機(jī)械分散法適于較柔軟的組織，如腦、肝、脾、淋巴結(jié)、胸腺、胚胎組織和腫瘤組織等。剪切組織為1mm3碎塊后，置于組織勻漿研磨，或用吸管反復(fù)吹打分散組織細(xì)胞組織液放在注射器內(nèi)通過針頭壓出。注射器針芯擠壓后，用PBS液洗滌，分別通過不銹鋼篩網(wǎng)80,150,400目孔徑篩網(wǎng)。記數(shù)活細(xì)胞數(shù)，制成細(xì)胞懸液接種。1.3.2.3消化分離法消化法是結(jié)合生化和化學(xué)手段把已剪切成較小體積的組織進(jìn)一步分化，獲得細(xì)胞懸液直接進(jìn)行培養(yǎng)1.3.2.3.1胰蛋白酶法主要作用是對細(xì)胞

7、間蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞離散?；钚砸韵业鞍椎哪芰y定，常用1：250消化效果與pH值、溫度、酶濃度和組織塊大小與硬度有關(guān)，對細(xì)胞分離作用與細(xì)胞的類型與性質(zhì)關(guān)系密切鈣鎂離子和血清抑制活性常用劑量為0.25%（0.1-0.5%），pH值8（8-9）溫度37。4度配制應(yīng)用液。1.3.2.3.2膠原酶法只對細(xì)胞間質(zhì)膠原組織起消化作用，使上皮細(xì)胞與膠原成份分離產(chǎn)品有I-VVII-IX等型，分別適用于分離肝細(xì)胞、胰島、脂肪細(xì)胞腎及纖維組織鈣鎂離子和血清不影響活性,pH.6.5-7常用劑量為200單位/ml或

8、0.1μg/ml~0.3μg/ml1.3.2.3.3EDTA法EDTA（二乙烯四乙酸二鈉）作用較緩和。主要作用：能從組織生長環(huán)境中吸取維持組織完整的鈣鎂離子。單獨(dú)使用不能使細(xì)胞完全分散，常用1:1的EDTA（0.02%）和胰蛋白酶0.25%混合液2原代培養(yǎng)也稱初代培養(yǎng),是從供體取得組織細(xì)胞后在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)。細(xì)胞保持原有的基本性質(zhì)，仍具二倍體遺傳物性。最接近和反映體內(nèi)生長特性。適合作藥物測試，細(xì)胞分化研究。原代培養(yǎng)細(xì)胞部分生物學(xué)特征尚不穩(wěn)定，供體和細(xì)胞間有很大差異。2.1組織塊培養(yǎng)法將組織剪