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《臨床醫(yī)學(xué)畢業(yè)論文重組人白介素18在畢赤酵母中的高效分泌表達(dá)》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、XX大學(xué)畢業(yè)論文重組人白介素18在畢赤酵母中的高效分泌表達(dá)2014年6月25日重組人白介素18在畢赤酵母中的高效分泌表達(dá)作者：楊莉莉，魏楓，劉虹，李慧，于津浦，任秀寶【摘要】廿的：構(gòu)建人白介索18(hIL18)真核表達(dá)載體，在畢赤酵母中高效分泌表達(dá)hIL18。方法：通過PCR法擴(kuò)增得到hIL18基因，構(gòu)建其真核表達(dá)載休pPICZaC/hIL1&電轉(zhuǎn)化畢氏酵母X33,PCR、SDSPAGE、Westernblot等方法篩選獲得高效表達(dá)rhIL18的工程菌株，疏水層析和陰離子交換層析純化表達(dá)產(chǎn)物，并初步測定其生物學(xué)活性。結(jié)果：rhIL18經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后其表達(dá)產(chǎn)量約為202mg/LoW
2、esternblot檢測了rhIL18的特異性結(jié)合活性;rhll18純化后純度達(dá)95%左右，并證明rhIL18能夠協(xié)同IL2誘導(dǎo)PBMC分泌IFN丫。結(jié)論：構(gòu)建了重組hIL18的基因工程菌，并在畢赤酵母中實現(xiàn)了高效分泌表達(dá),為進(jìn)一步研究英活性和功能奠定了基礎(chǔ)。【關(guān)鍵詞】人白細(xì)胞介索18;畢赤酵母；表達(dá)；純化口細(xì)胞介素18(IL18)/乂稱IFN丫誘導(dǎo)因子(IGIF),主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子［l］o人IL18前體蛋白由193個氨基酸組成，天然IL18的活化依賴丁IL1轉(zhuǎn)化酶(Interleukin1conversingenzyme,ICE)的特異裂解作用，從詢體IL18的N
3、端切除36個氨基酸殘基而使之活化［2］oIL18的生物學(xué)活性與IL12相似，能促進(jìn)T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)T細(xì)胞分泌IFN丫、GMCSF,抑制IL4和IL10產(chǎn)生，增強NK及Thl細(xì)胞的細(xì)胞毒活性等;IL18的表達(dá)還與自身免疫病、腫瘤及感染冇關(guān)［3,4］,IL18在抗腫瘤及抗病毒等方面具有潛在的應(yīng)用前景［5,6］。目前關(guān)于IL18制備的報道主耍集中在原核表達(dá)體系［2,7］,但出于原核表達(dá)體系產(chǎn)量較低，且存在復(fù)性得率低等一些問題，使得其生產(chǎn)成木較高。為了更好的研究hIL18特性，探索新的生物學(xué)活性，我們在真核表達(dá)休系畢赤酵母中表達(dá)hIL18,試圖得到大量hIL18蛋白，更好的開展hIL1
4、8體內(nèi)或體外活性研究。本研究從胎兒肝臟組織克隆了人IL18成熟肽(即從第37位氨基酸到193位氨基酸)基因，構(gòu)建了真核重組表達(dá)質(zhì)粒，利用畢赤酵母0（交配因了信號肽引導(dǎo)重組hIL18（rhIL18）成熟肽的分泌表達(dá)，探索了純化方法，并對其活性進(jìn)行了初步研究。1材料和方法1.1材料pPICZaC質(zhì)粒和畢赤酵母菌株X33購門Invitrogen公司;E.coliDH5a購自北京鼎國生物公司；PCR引物由上海生物工程公司合成；限制性內(nèi)切酶及T4DNA連接酶購自大連寶生物公司；PhenlySepharose6FF,QSepharoseHP購于美國GE公司。淋巴細(xì)胞分離液購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院
5、血液學(xué)研究所；山羊抗人IL18抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體購口SantaCruz公司。口動玻璃發(fā)酵罐（KLF2000型）為瑞士比歐（Bioengineer）公司產(chǎn)品；蛋白純化儀（型號AKTAexplorer10）為美國GE公司產(chǎn)品。1.2方法1.2.1hIL18基因的克隆及載體構(gòu)建提取胎兒肝臟組織RNA,以其為模板，根據(jù)GenBank公布序列（AccessionNo.BC007007.）設(shè)計引物，上游引物為5，CCGCTCGAGAAGAGATACTTTGGCAAG3,下游引物為5’GCCGCTCTAGATTAGTCTTCGTTTTGAACAG3（Xho
6、I和XbaI劃線所示）,PCR擴(kuò)增得到含hIL18成熟肽基因片段。為了終止C端Histag的表達(dá)，下游引物中XbaI的而面加入終止密碼了。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用XhoI和XbaI酶切庇連于用同樣酶切的載體pPICZaC得到質(zhì)粒pPICZaC/hIL18。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化人腸桿菌DH5a,涂于含25mg/LZeocinLB平板上，切鑒定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物并測序，提取鑒定正確的陽性克隆質(zhì)粒用于表達(dá)。1.2.2質(zhì)粒pPICZaC/IL18的轉(zhuǎn)化及鑒定將重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZaC/hIL18以PmeI線性化，純化回收。將15
7、ig線性pPICZaC/hIL18電轉(zhuǎn)化至新鮮制備的酵母感受態(tài)細(xì)胞X33屮，并同
8、吋轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒pPICZaC和空酵母菌作對照，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于YPD平板（Zeocin的濃度為100mg/L）。28°C培養(yǎng)2?3d至長出菌落。在YPD平板(Zeocin抗性)上挑取20個克隆，提取轉(zhuǎn)化的畢赤酵母菌基因組DNA,以其為模板，以上面提到的特異引物進(jìn)行PCR鑒定，并以未轉(zhuǎn)化的酵母菌基因組DNA和空質(zhì)粒pPICZaC轉(zhuǎn)化的酵母菌基因組DNA作對照,PCR鑒定質(zhì)粒pPICZaC/hIL18是否穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。1.2.1搖瓶環(huán)境rhIL18的表達(dá)經(jīng)鑒定的重組陽性克隆pPICZaC/IL18/X3
