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1、重組人VEGF165蛋白在畢赤酵母中高效表達(dá)與多克隆抗體的制備王曉1,2，黃曉平1,2，周宇1,2，刁勇收稿日期：通信作者：刁勇（1967年），男，教授，主要從事新藥研發(fā)、基因藥物研究.E-mail:diaoyong@hqu.edu.cn基金項(xiàng)目：國家自然基金(No.81271691)，國際科技合作項(xiàng)目(No.2011DFG33320)，福建省科技重大項(xiàng)目(No.2013N5007)，華僑大學(xué)校級基金(No.11HZR19)資助。,2*（1：華僑大學(xué)分子藥物研究院，福建泉州362021；2：華僑大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院，福建泉州362021）摘要：VEGF在大多數(shù)腫瘤中表達(dá)上調(diào),是腫
2、瘤新生血管生成最重要的細(xì)胞因子，臨床上VEGF的抗體可以抑制腫瘤的發(fā)展。為深入研究VEGF165的生物活性及VEGF165抗體在腫瘤治療中的作用，本文構(gòu)建pPIC9K-VEGF165分泌型載體，線性化后電擊轉(zhuǎn)化至GS115(his4)中，經(jīng)MD平板篩選出陽性表達(dá)菌株并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。菌株發(fā)酵上清液經(jīng)SephadexG-25，HeparinSepharoseFF和SephacrylS-100層析介質(zhì)分離純化，目的蛋白純度達(dá)到95%，分子量約為24KD。重組人VEGF165蛋白能夠誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞增殖、提高HUVEC細(xì)胞的活性。重組人VEGF165蛋白免疫小鼠，制備多克隆抗體，
3、間接ELISA法檢測抗體效價(jià)達(dá)1：51200。重組人VEGF165蛋白的表達(dá)及多克隆抗體的成功制備為進(jìn)一步探索VEGF165在腫瘤形成中的作用以及VEGF165抗體治療腫瘤的作用奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵字：重組人VEGF165蛋白；多克隆抗體；畢赤酵母；中圖分類號：文獻(xiàn)標(biāo)志碼：AHighlevelexpressionofrecombinanthumanVascularEndothelialGrowthFactor165proteininPichiapastorisandPreparationofVEGF165PolyclonalAntibodyWangXiao1,2，HuangXia
4、o-ping1,2，ZhouYu1,2,DiaoYong1,2*（1:InstituteofMolecularMedicine，HuaqiaoUniversity，Quanzhou362021；2:SchoolofBiomedicalSciencesHuaqiaoUniversity，Quanzhou362021）Abstract:Asthesinglemostpotentangiogenesisfactor,VascularEndothelialGrowthFactor(VEGF)weredetectedup-regulatedexpressioninmosttumors,
5、andantibodiesofwhichwereshowntosuppresstumordevelopmentclinically.InordertostudythebiologicalactivityofVEGF165andtheeffectofVEGF165antibodyinanti-tumortherapy,therecombinantsecretoryvectorofpPIC9K-VEGF165wasconstructed,linearizedandthentransformedintoPichiapastorisstrainGS115(his4)byelectro
6、poration.ThepositivetransformantswereseperatedbyMDplatescreeningandconfirmedbyPCRreaction.Subsequently,therhVEGF165proteinwasobtainedbypurificationfromthesupernatantwithSephadexG-25、HeparinSepharoseFFandSephacrylS-100gelfiltrationchromatographwithmolecularweightof24kDandpurityof95%,showingb
7、ySDS-PAGE.Furthermore,therecombinantproteinwasfoundtohavehighpotencyofinducingHUVECcellproliferationandimprovingHUVECcellactivity.ThepolyclonalantibodygeneratedfromrhVEGF165immunizedmouseexertsthetiterof1:51200byindirectELISAanalysis.Thesuccessfulexpress
