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1、產(chǎn)油霉菌油脂提取方法的研究摘要：以產(chǎn)油霉菌雅致小克銀漢霉為例進(jìn)行了前處理及油脂提取方法的研究，采用了酸熱法、反復(fù)凍融法以及超聲波和酶結(jié)合法破碎細(xì)胞，甲醇-氯仿提取油脂以及乙醚、石油醚索氏抽提法直接提取油脂。結(jié)果表明，超聲波和酶結(jié)合使用破碎細(xì)胞，甲醇-氯仿提取油脂的效果較好；索式抽提法采用石油醚為提取劑效果較好。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析檢測(cè)油脂脂肪酸組成為棕櫚酸25.10%,油酸25.17%,亞油酸20.99%,硬脂酸4.78%。關(guān)鍵詞：產(chǎn)油霉菌細(xì)胞破碎提取油脂得率分類號(hào)：Q819文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)1672-3791(2015)08(b)-0000-00開發(fā)利用微生物進(jìn)行
2、油脂的生產(chǎn)已經(jīng)成為當(dāng)今的一大熱點(diǎn)，不但可以作為動(dòng)植物油脂的必要補(bǔ)充，在促進(jìn)人類保健方面起著越來(lái)越重要的作用，還可以作為生產(chǎn)生物柴油的油源，對(duì)解決當(dāng)今世界各國(guó)油脂原料供應(yīng)問(wèn)題、促進(jìn)生物柴油的推廣使用、解決環(huán)境問(wèn)題和人類能源問(wèn)題等都具有重要的意義［1-2］。由于不同種類的微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)不同，如霉菌有堅(jiān)韌的細(xì)胞壁，使我們不能直接獲得油脂或者只能獲得少量油脂，因此，提取前用前處理方法破壞菌體細(xì)胞就顯得非常必要［3］。本研究主要以產(chǎn)油霉菌雅致小克銀漢霉為例進(jìn)行了前處理及油脂提取方法的研究，為今后大規(guī)模生產(chǎn)微生物油脂奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1.1菌種雅致小克銀漢霉菌株：中國(guó)工業(yè)菌種保
3、藏中心購(gòu)買。1.2培養(yǎng)基及主要試劑(1)PDA固體培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂16g，蒸餾水lOOOmL,115°C滅菌20min。(2)限氮培養(yǎng)基：葡萄糖40g/L，(NH4)2S041.5g/L,KN030.5g,KH2P047g/L,NaH2P042g/L,蒸餾水lOOOmL，115°C滅菌20min。(3)各種試劑均為分析純。1.3方法1.3.1雅致小克銀漢霉菌株的培養(yǎng)將PDA固體培養(yǎng)基斜面低溫保存的雅致小克銀漢霉菌株接入到限氮培養(yǎng)基中，于28°C，180r/min的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)5d;離心收集菌體，用于油脂提取研究。1.3.2油脂提取方法采用酸熱
4、法［4］、反復(fù)凍融法［5］以及超聲波和酶結(jié)合法［6］破碎細(xì)胞，甲醇-氯仿提取油脂［7］以及乙醚、石油醚索氏抽提法［8］直接提取油脂。1.3.3油脂脂肪酸成分分析稱取油脂0.5g，加1%硫酸-甲醇20mL與70°C水浴加熱30min,加入20mL正己烷提取甲酯化產(chǎn)物，取出上清，再用10mL正己烷清洗一次，合并上清，放入瓶中。用GC-MS-2010-plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)油脂成分。2結(jié)果與討論2.1酸熱法提取油脂的研究用不同濃度的鹽酸溶液對(duì)菌株進(jìn)行細(xì)胞破碎，用甲醇_氯仿溶液萃取，計(jì)算油脂得率，結(jié)果如圖1所示。1鹽酸濃度對(duì)油脂得率的影響結(jié)果表明，油脂得率與鹽酸濃度有關(guān)，
5、在一定的濃度范內(nèi)，得率隨濃度的增加而增加，超過(guò)這個(gè)范圍后，得率隨濃度的增加而減小，可能由于鹽酸濃度過(guò)高，會(huì)水解油脂，使收率降低。2.2反復(fù)凍融法提取油脂的研究使用凍融法對(duì)菌株進(jìn)行破碎，甲醇-氯仿提取油脂?？疾觳煌瑑鋈诖螖?shù)對(duì)油脂提取的影響，結(jié)果如圖2所示。2凍融次數(shù)對(duì)油脂得率的影響隨著凍融次數(shù)的增加，油脂得率增加，但增加的不明顯。此方法破碎細(xì)胞，提取的油脂量較低。反復(fù)凍融法是通過(guò)溫度的突然變化，在細(xì)胞內(nèi)形成冰粒，發(fā)生溶脹破碎，由于耗時(shí)較長(zhǎng)，部分細(xì)胞產(chǎn)生了自溶使油脂含量減少。2.3超聲波與酶結(jié)合法提取油脂的研究先用纖維素酶處理菌體細(xì)胞壁，然后改變超聲次數(shù)破碎菌體，用甲醇-氯仿提
6、取油脂，結(jié)果如圖3所示。3超聲次數(shù)對(duì)油脂得率的影響該法采用了酶法和機(jī)械法相結(jié)合，酶作用后大部分細(xì)胞壁裂解，再利用超聲波產(chǎn)生獨(dú)特的機(jī)械振動(dòng)作用使細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，促使細(xì)胞破。結(jié)果表明，破碎后測(cè)得的油脂含量隨超聲次數(shù)的增加而增大，當(dāng)達(dá)到一定次數(shù)時(shí)，油脂得率趨于穩(wěn)定，此方法提取的油脂量與其它方法相比最高，油脂得率達(dá)24%。2.4索式抽提法分別以乙醚和石油醚為溶劑，在相同條件下用索式抽提法提取油脂，測(cè)得的油脂得率分別為12%和14.8%，表明石油醚的抽提效果較乙醚好。選擇石油醚為提取劑，測(cè)定不同時(shí)間的油脂得率，結(jié)果如圖4所示。4抽提時(shí)間對(duì)油脂得率的影響上圖表明抽提時(shí)間越長(zhǎng)，油脂得率
7、越高，在抽提9h到10h時(shí)，油脂得率升高明顯。2.5油脂脂肪酸成分分析使用GC-MS-2010-plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)油脂成分，結(jié)果如表1所示。經(jīng)過(guò)分析測(cè)定該菌株油脂的成分主要是棕櫚酸、油酸、亞油酸、硬脂酸，與植物脂肪酸的成分相似，可作為生物柴油的原料。表1菌株的脂肪酸組成名稱分子量脂肪酸組成％油酸甲酯29626.23棕櫚酸甲酯27025.45亞油酸甲酯29419.79硬脂酸甲酯2985.673結(jié)論(1)分別研究了酸熱法、反復(fù)凍融法以及超聲波和酶結(jié)合法破碎細(xì)胞，甲醇-氯仿提取油脂以及乙醚、石油醚索氏抽提法
