豬囊尾蚴的實(shí)驗(yàn)室診斷

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1、豬囊尾蚴的實(shí)驗(yàn)室診斷董杰（黑龍江省拜泉縣長(zhǎng)春鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站164724）1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)抗原采用豬囊尾蚴的囊液，經(jīng)親和層析純化、濃縮、分裝后，于-20℃保存，使用前，用0.1MpH值9.6醋酸鹽緩沖液稀釋，使蛋白含量為30毫克/分升.酶結(jié)合物用兔抗豬IgG免疫血清，經(jīng)硫酸銨鹽析沉淀，再經(jīng)DEAE?纖維素純化提取免疫抗豬IgG抗體，用辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗豬IgG，經(jīng)酶活力測(cè)定，應(yīng)用時(shí)最適稀釋濃度為1∶1000。操作方法為，以40孔聚苯乙烯微量反應(yīng)為固相載體，每凹孔加稀釋抗原液0.2毫升，置于4℃冰箱過夜，或30℃2小時(shí)，用pH值7.4PBS?吐溫20洗滌3次，每次3分鐘

2、，抽干，加以PBS?吐溫20稀釋的被檢血清0.2毫升，同份血清同同時(shí)試驗(yàn)2孔，置于37℃水浴箱孵育30分鐘，同前洗滌，加1∶1000稀釋的酶結(jié)合物0.2毫升，37℃水浴箱孵育30分鐘，同前洗滌，加底物過氧化氫?鄰苯二胺溶液0.2毫升，37℃15分鐘后加2M硫酸0.05毫升終止反應(yīng)。之后，將微量反應(yīng)板移入酶標(biāo)記光度計(jì)內(nèi)，于492納米波長(zhǎng)測(cè)定光密度（OD值），每次試驗(yàn)均設(shè)置陽性陰性參考血清和PBS?吐溫20空白對(duì)照。以參考陽性血清的OD值作0.1.待測(cè)血清的OD值大于或等于陽性參考血清的OD值時(shí)為陽性，低于此值為陰性。陽性豬反應(yīng)液呈鮮明的橙黃色，陰性豬反應(yīng)液呈淺的淡黃色，兩

3、者眼觀對(duì)比有明顯差別，易于判定。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，選定抗原的稀釋度為30微克/毫升，血清稀釋度為1∶50。間接血凝集試驗(yàn)是一種敏感度很高的血清學(xué)試驗(yàn)，在豬囊尾蚴病的診斷上取得了很好的效果。從新鮮的豬囊尾蚴豬肉剝離整個(gè)蟲體，吸取囊液混合后離心沉淀，取上清液即為囊尾蚴液抗原。用2.5%戊二醛處理過的2.5%鞣酸化羊紅細(xì)胞與等量稀釋的囊尾蚴液抗原混合，于37℃水浴中攪拌30分鐘，離心去上清液，磷酸鹽緩沖液洗3次，再懸浮于含2%滅活兔血清的磷酸鹽緩沖液中，制成1%羊紅細(xì)胞懸濁液即為致敏羊紅細(xì)胞，4℃保存?zhèn)溆?。?.5%鞣酸化羊紅細(xì)胞離心去上清液，用含2%滅活兔血清的磷酸鹽緩沖液制成1

4、%羊紅細(xì)胞懸液，作為對(duì)照羊紅細(xì)胞，4℃保存?zhèn)溆?。取受檢血清0.05毫升，加9倍量的對(duì)照羊紅細(xì)胞放室溫10分鐘，以吸收嗜異性抗體。離心沉淀后，取上清液，即為1∶10受檢血清，再用磷酸鹽緩沖液稀釋為1∶50。每份受檢的稀釋血清，用9支試管作2倍遞減稀釋：向1、2、9三支試管內(nèi)各加入上述稀釋血清0.1毫升，向2~8管各加入磷酸鹽緩沖液0.1毫升，從第2管吸出0.1毫升放入第3管，同法依次稀釋至第8管，最后從第八管吸出0.1毫升棄去，使1~8管分別含1∶50，1∶100，1∶200，……1∶6400的稀釋血清0.1毫升，第9管作為血清對(duì)照管。第1~8管加致敏羊紅細(xì)胞1滴（0.0

5、5~0.06毫升），第9管加對(duì)照羊紅細(xì)胞1滴，充分混勻后，放置室溫內(nèi)靜置2~3小時(shí)，待紅細(xì)胞完全沉淀后記錄結(jié)果。效價(jià)測(cè)定：依凝集程度分為0，0.25，0.50，0.75和100%共5個(gè)等級(jí)，分別以0、1、2、3、4數(shù)字代替。管底出現(xiàn)均勻緊密的顆粒性凝集、細(xì)邊，紅細(xì)胞沉集范圍小于管底直徑的2/3而仍大于1/2，即為3級(jí)凝集；若只有少量凝集，但邊緣加粗，紅細(xì)胞沉集范圍等于管底直徑的1/2者為2級(jí)凝集；同上，但其紅細(xì)胞沉集范圍小于管底直徑的1/2者，為1級(jí)凝集；完全不凝集，管底中心呈清楚的暗紅鈕狀者為0級(jí)。凡受檢血清稀釋1∶50或更大，仍發(fā)生超2級(jí)反應(yīng)者確定為囊尾蚴病間接血凝

6、試驗(yàn)陽性，而對(duì)照均應(yīng)為陰性，否則應(yīng)當(dāng)重做。2環(huán)狀沉淀反應(yīng)用新鮮的豬囊尾蚴經(jīng)過丙酮、乙醚的處理，取其干燥的蟲粉以生理鹽水浸漬24小時(shí)后，經(jīng)細(xì)菌濾斗過濾所制備的抗原，稀釋到4000倍具有診斷價(jià)值，但陽性反應(yīng)的滴度可高達(dá)3200倍。為提高抗原的特異性，除了注意和防止可能出現(xiàn)的某些非特異性干擾因素外，進(jìn)行了硫酸銨分層和熒光分析，其方法是將新鮮豬囊尾蚴的全蟲置于熒光燈的暗室，在紫外光的照射下發(fā)出明亮的紅色熒光。如分成頭節(jié)、囊液和囊膜3部分，分別進(jìn)行熒光檢查，則只有囊液可以觀察到明亮的熒光物質(zhì)。為了從囊液中提取此熒光物質(zhì)，用酒精混于囊液中，可將此物同蛋白質(zhì)一樣沉淀出來，取此沉淀物再

7、進(jìn)行熒光檢查，可見強(qiáng)烈的熒光。再將此有強(qiáng)烈熒光的沉淀物用各種不同的飽和程度的硫酸銨進(jìn)行分層，析出不同的沉淀，再作紫外熒光的比較分析。