酵母雙雜交技術(shù).docx

《酵母雙雜交技術(shù).docx》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。

1、酵母雙雜交系統(tǒng)1．原理???酵母雙雜交系統(tǒng)的建立得力于對真核細胞調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認識。研究發(fā)現(xiàn)，許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子都是由兩個可以分開的、功能上相互獨立的結(jié)構(gòu)域(domain)組成的。例如，酵母的轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4，在N端有一個由147個氨基酸組成的DNA結(jié)合域(DNAbindingdomain,BD)，C端有一個由113個氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄激活域(transcriptionactivationdomain,AD)。GAL4分子的DNA結(jié)合域可以和上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結(jié)合，而轉(zhuǎn)錄激活域則能激活U

2、AS下游的基因進行轉(zhuǎn)錄。但是，單獨的DNA結(jié)合域不能激活基因轉(zhuǎn)錄，單獨的轉(zhuǎn)錄激活域也不能激活UAS的下游基因，它們之間只有通過某種方式結(jié)合在一起才具有完整的轉(zhuǎn)錄激活因子的功能。2．試驗流程???酵母雙雜交系統(tǒng)正是利用了GAL4的功能特點，通過兩個雜交蛋白在酵母細胞中的相互結(jié)合及對報告基因的轉(zhuǎn)錄激活來捕獲新的蛋白質(zhì)，其大致步驟為:2．1、視已知蛋白的cDNA序列為誘餌(bait)，將其與DNA結(jié)合域融合，構(gòu)建成誘餌質(zhì)粒。2．2、將待篩選蛋白的cDNA序列與轉(zhuǎn)錄激活域融合，構(gòu)建成文庫質(zhì)粒。2．3、將這兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化于酵母細胞中。2．4、酵母細胞中，已分離的DNA

3、結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域不會相互作用，但誘餌蛋白若能與待篩選的未知蛋白特異性地相互作用，則可激活報告基因的轉(zhuǎn)錄；反之，則不能。利用4種報告基因的表達，便可捕捉到新的蛋白質(zhì)。3．特點優(yōu)點蛋白--蛋白相互作用是細胞進行一切代謝活動的基礎(chǔ)。酵母雙雜交系統(tǒng)的建立為研究這一問題提供了有利的手段和方法。缺點???盡管該系統(tǒng)己被證實為一種非常有效的方法，但它也有自身的缺點和問題。1、它并非對所有蛋白質(zhì)都適用，這是由其原理所決定的。雙雜交系統(tǒng)要求兩種雜交體蛋白都是融合蛋白，都必須能進入細胞核內(nèi)。因為融合蛋白相互作用激活報告基因轉(zhuǎn)錄是在細胞核內(nèi)發(fā)生的。2、假陽性的發(fā)生較為頻繁。所謂

4、假陽性，即指未能與誘餌蛋白發(fā)生作用而被誤認為是陽性反應(yīng)的蛋白。而且部分假陽性原因不清，可能與酵母中其他蛋白質(zhì)的作用有關(guān)。3、在酵母菌株中大量表達外源蛋白將產(chǎn)生毒性作用，從而影響菌株生長和報告基因的表達。使用酵母雙雜交技術(shù)應(yīng)注意的問題???真正明了酵母雙雜交技術(shù)的主要原理及篩選方法是進行酵母雙雜交實驗的前提，構(gòu)建成功的誘餌質(zhì)粒及大量的材料準備是進行酵母雙雜交實驗的保證。只有明了雙雜交的原理，才有可能設(shè)計實驗進程、才能有目的的進行材料準備，并能對實驗結(jié)果作出預(yù)測與分析，尤其要對具體實驗中各種選擇性壓力培養(yǎng)基的使用目的要十分清楚。大量的材料準備、較長的實驗流程是酵

5、母雙雜交有別于其他實驗的特點，而其操作技術(shù)本身并不十分困難。特別應(yīng)提出的是，一個陽性克隆的編號往往要被反復(fù)記錄多次，因此，要時時注意編號的正確性。另外，若從公司購得待篩選的酵母cDNA文庫，應(yīng)注意不同的公司有不同的產(chǎn)品，且各公司的產(chǎn)品不斷更新?lián)Q代，要認真閱讀實驗指導(dǎo)手冊，以防出現(xiàn)失誤。4．應(yīng)用研究已知蛋白間的相互作用、尋找在蛋白—蛋白相互作用中起關(guān)鍵作用的結(jié)構(gòu)域、尋找與靶蛋白相互作用的新蛋白。相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與推廣，酵母雙雜交技術(shù)在今后的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中將發(fā)揮更大的作用。酵母雙雜交系統(tǒng)操作方法LexA酵母雙雜交系統(tǒng)簡介一、LexA酵母雙雜交系統(tǒng)的

6、設(shè)計原理報告質(zhì)粒p8op-LacZ的GAL4UAS編碼序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活劑的情況下，報告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄活性為零，該基因的篩選標志為URA3，可以作為有自主復(fù)制能力的質(zhì)粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因組DNA上。質(zhì)粒pLexA的篩選標志為HIS3，在雙雜交系統(tǒng)中用于表達DNA-BD(202個氨基酸殘基組成的LexA蛋白)與目標蛋白(釣餌，Bait)的融合蛋白，該融合體的表達受酵母強啟動子ADH1的調(diào)控，選擇與報告基因的操縱子LexA×8結(jié)合。質(zhì)粒pB42AD的篩選標志為TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位

7、點(EcoRI與XhoI)上游，含有SV40核定位(SV40nuclearlocalization)、HA(血凝素)及AD(來自于E.coli的88個氨基酸殘基組成的B42蛋白)等幾種編碼序列，共同組成可以啟動報告基因轉(zhuǎn)錄表達的激活成份。在酵母EGY48的基因組中還整合有另一個報告基因Leu，它與LacZ報告基因具有相同的操縱子-LexA，但兩者啟動子不同。根據(jù)雙雜交系統(tǒng)的原理，如果某一復(fù)合物同時具有DNA-BD和AD的活性，即可激活報告基因的轉(zhuǎn)錄和表達。分別將待測蛋白X、Y的編碼序列插入pLexA質(zhì)粒載體和pB42AD質(zhì)粒載體的多克隆位點中，然后共同轉(zhuǎn)入含

8、有報告基因的酵母菌株，如果蛋白X與Y能相互作用，則啟