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《smart 技術(shù)構(gòu)建腎乳頭狀腺癌及癌旁組織的cdna文庫論文》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、SMART技術(shù)構(gòu)建腎乳頭狀腺癌及癌旁組織的cDNA文庫論文成瑜李旭陳葳楊玉琮【關(guān)鍵詞】腎腫瘤ConstructionofcDNAlibrariesofrenalpapillaryadenocarcinomatissueanditssidetissueatissueanditssidetissuebySMARTtechnology.METHODS:Sechanismat5′endofmRNAtemplatetechnology,SMARTtechnology,plate,PoplateRNAtoe
2、nrichthefulllengthcDNAs.Afteramplification,thedscDNAns(CHROMASPIN400)andthenrebinedtotheλTripIEx2vector.Afterpackage,thelibrariesinedandthenthecDNAlibrariesplified.RESULTS:ThetiterofthecDNAlibrariesofrenalpapillaryadenocarcinomatissueanditssidetissue
3、L-1and2.6×106pfumL-1,respectively.Afteramplification,theratesincreasedto6×1011pfumL-1and9×1011pfumL-1,respectively.CONCLUSION:OursuccessfullyconstructedcDNAlibrariesarefulllengthlibrariesa.【Keys;cDNAlibrary;SMART【摘要】目的：運(yùn)用SMART技術(shù)構(gòu)建腎乳頭狀腺癌及癌旁組織的cDNA文庫.方
4、法：運(yùn)用mRNA5′末端的模板轉(zhuǎn)換方法，即SMART技術(shù)，以純化的Poly(A)+RNA為模板，用PoRNA的5′末端添加一段5′oligo作為延伸后的模板，從而富集全長cDNA.cDNA擴(kuò)增后，經(jīng)sfiI酶切、CHROMASPIN400洗脫，與λTripIEx2載體連接并用載體蛋白包裝后.freelL-1和2.6×106pfumL-1，重組率均98%，擴(kuò)增后滴度分別達(dá)6×1011pfumL-1和9×1011pfumL-1.結(jié)論：我們構(gòu)建的人腎乳頭狀腺癌及癌旁組織cDNA文庫為高效、全長cDNA
5、文庫，可以用做探針、抗體等免疫學(xué)篩選,進(jìn)一步探尋與腎乳頭狀腺癌相關(guān)的基因.【關(guān)鍵詞】腎腫瘤；cDNA文庫;SMART技術(shù)0引言腎癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，生物學(xué)行為極為多變，其發(fā)病機(jī)制及發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)基礎(chǔ)至今不明.鑒于此，我們利用SMART(sechanismat5′endofmRNAtemplate)技術(shù)分別構(gòu)建了腎乳頭狀腺癌及其癌旁組織的cDNA文庫，為腎乳頭狀腺癌相關(guān)基因的研究工作奠定了基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料人腎乳頭狀腺癌和癌旁正常組織(距癌組織1.5cm以上)由西安交
6、通大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科提供.TRIzol試劑購自Gibco公司;SMARTTMcDNAlibraryconstructionkit購自Clontech公司;OligotexTMdT30mRNApurificationkit購自Takara株式會社;載體包裝蛋白為Epicentre產(chǎn)品;IPTG,XGal購于Promega公司，其余均為國產(chǎn)分析純.1.2方法1.2.1總RNA提取及mRNA純化人腎乳頭狀腺癌和癌旁組織各0.5g入預(yù)冷的勻漿器中，隨即加入TRIzol5mL，于冰浴中研磨成勻漿，氯仿異
7、丙醇抽提，750mLL-1乙醇洗滌干燥后溶于200μL無RNase水中［1］.mRNA提取按照OligotexTMdT30mRNApurificationkit操作說明書進(jìn)行.1.2.2cDNA文庫的構(gòu)建取1.0~1.5μgPoly(A)+RNA，以5′oligo(5′AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG3′)及3′oligo(dT)［5′ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGd(T)30N’N3’,.freelin,95℃20s,隨后進(jìn)
8、行循環(huán):95℃5s，68℃8min，其中腎乳頭狀腺癌進(jìn)行4個循環(huán)，癌旁組織進(jìn)行5個循環(huán)（PE擴(kuò)增儀2400型）.PCR反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液經(jīng)蛋白酶K處理以去除其中的酶類，合成的雙鏈cDNA用sfiI酶切及CHROMASPIN400柱層析洗脫，收集0.5～5.0kb之間的組分，在T4DNA連接酶作用下，將dscDNA與λTripIEx2載體（經(jīng)sfiI酶處理過）的去磷酸化臂連接，16℃水浴過夜.隨后置冰浴中2h，65℃水浴滅活連接酶，于30℃進(jìn)行包裝.1.2.3文庫滴定、重組率測定和擴(kuò)增cDNA文庫
