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1、圣和散對腦膠質瘤細胞誘導分化的研究夏躍勝王建華吳永忠王歡【關鍵詞】圣和散；,,,腦膠質瘤；,,分化 摘要：目的觀察圣和散對腦膠質瘤C6細胞株體外生長及誘導分化的作用。方法用圣和散處理腦膠質瘤C6細胞，采用甲基噻唑基四唑(MTT)比色法檢測圣和散對C6細胞增殖的抑制作用,以免疫組化SABC法檢測膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和c-myc表達。結果圣和散可顯著抑制C6細胞體外增殖，并呈現時間、劑量依賴性。在終濃度為5mg/ml和10mg/ml時,對C6增殖的抑制率達(49.62±1.13)%和(69.38±1.42)%，明顯優(yōu)于對照組（P＜0.01）。免疫組化可見SHP組較對照組GFA
2、P表達明顯增強，c-myc表達下降。結論圣和散對膠質瘤C6細胞系的增殖有明顯的抑制作用，能通過誘導分化降低腦膠質瘤細胞惡性程度?！ ￡P鍵詞：圣和散；腦膠質瘤；分化 InducingDifferentiationEffectofShenghePoaCells Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectsofShenghePoaC6celllineinvitro.MethodsBraingliomaC6cellline(MTT)easuretheleveloftheproliferationofC6culturedycofC6cellsmuno
3、histochemicalSABCmethod.ResultsTheproliferationofC6e-dependentmanner.Theinhibitoryrateg/mland10mg/ml,paredycdecreasedsignificantlyinC6cellsculturedalignantdegreebyinducingdifferentiationoftheC6cells. Keya;Differentiation 腦膠質瘤是常見的腦腫瘤之一，由于其位置的特殊性和腫瘤本身的高侵襲性，手術難以徹底切除，術后復發(fā)率高，即使聯合放化療,預后仍很差〔1,2〕。圣和
4、散是我院多年來用于治療腦膠質瘤的方藥，它能否抑制腦膠質瘤增殖，誘導其分化是本實驗研究的目的?！ ?材料與方法 1.1材料鼠源性膠質細胞瘤C6細胞系（引自第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院）;DMEM細胞培養(yǎng)基（美國Gibco公司）;甲基噻唑基四唑(MTT)、碘化丙錠（PI）、GFAP單抗、免疫組化SABC試劑盒（美國Sigma公司）；c-myc單抗（英國Novo公司）;酶聯免疫儀（華東電子管廠DG5031型）?！ ?.2方法 1.2.1細胞培養(yǎng)鼠源性膠質細胞瘤C6細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml慶大霉素的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2、飽和濕度培
5、養(yǎng)箱內傳代培養(yǎng)。2d換液1次，0.25%胰酶消化，傳代?！ ?.2.2藥物處理將中藥SHP（主要含黨參、太子參、玄參、炒白術、薏苡仁、土鱉蟲、白花蛇舌草、肉蓯蓉、蟾蜍、甘草）經多酶乳化流程水提后〔3〕，噴霧得干燥粉末，取適量磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解，上清用0.22μm的濾過膜過濾，配制成濃度10mg/ml的藥液?！ ?.2.3細胞生長抑制測定取對數生長期C6細胞,用0.25%胰蛋白酶消化,10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基配制成104個/ml單細胞懸液,取100μl(含103個細胞)加入96孔板中,培養(yǎng)4h,細胞貼壁,分為實驗組(加SHP,終濃度分別為2.5,5,10mg/ml)和空白
6、對照組(不加SHP),培養(yǎng)于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),72h后,加入MTT10μl/孔,繼續(xù)培養(yǎng)4h,吸去培養(yǎng)液,加入DMSO100μl,將培養(yǎng)板振蕩5min,20min以內以570nm為測試波長,630nm為參考波長,在全自動酶標儀上讀取各孔吸光度(A值),每組8孔。腫瘤細胞生長抑制率的計算：抑制率(%)=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%?！ ?.2.4免疫組化SABC染色法檢測GFAP和c-myc表達在規(guī)定培養(yǎng)時間取SHP處理組和對照組的C6細胞爬片,洗滌后經純丙酮室溫固20～30min,蒸餾水洗;純甲醇加H2O2至0.5%,室溫浸泡30min。蒸餾水洗3
7、次；滴加正常山羊血清封閉液,室溫20min后甩去多余液體；分別滴加適當稀釋的一抗(1∶100)GFAP(小鼠IgG)和c-myc單抗,37℃1h,0.1mol/LPBS洗2min3次;滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,37℃20min,0.1mol/LPBS洗2min3次;滴加試劑SABC,37℃20min,0.1mol/LPBS洗5min4次;室溫下DAB顯色,蒸餾水洗滌,在400倍光鏡下觀察,陽性反應細胞核呈棕色或棕黃色。PBS代替一抗作空白對照。每張切片隨機抽取視野
