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1、圣和散對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究作者：夏躍勝王建華吳永忠王歡【關(guān)鍵詞】圣和散；,,,腦膠質(zhì)瘤；,,分化 摘要：目的觀察圣和散對(duì)腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞株體外生長(zhǎng)及誘導(dǎo)分化的作用。方法用圣和散處理腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞，采用甲基噻唑基四唑(MTT)比色法檢測(cè)圣和散對(duì)C6細(xì)胞增殖的抑制作用,以免疫組化SABC法檢測(cè)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和c-myc表達(dá)。結(jié)果圣和散可顯著抑制C6細(xì)胞體外增殖，并呈現(xiàn)時(shí)間、劑量依賴性。在終濃度為5mg/ml和10mg/ml時(shí),對(duì)C6增殖的抑制率達(dá)(49.62±1.13)%和(69.3
2、8±1.42)%，明顯優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.01）。免疫組化可見SHP組較對(duì)照組GFAP表達(dá)明顯增強(qiáng)，c-myc表達(dá)下降。結(jié)論圣和散對(duì)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞系的增殖有明顯的抑制作用，能通過誘導(dǎo)分化降低腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性程度?！ ￡P(guān)鍵詞：圣和散；腦膠質(zhì)瘤；分化 InducingDifferentiationEffectofShenghePoaCells Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectsofShenghePoaC6celllineinvitro.MethodsBrai
3、ngliomaC6cellline(MTT)easuretheleveloftheproliferationofC6culturedycofC6cellsmunohistochemicalSABCmethod.ResultsTheproliferationofC6e-dependentmanner.Theinhibitoryrateg/mland10mg/ml,paredycdecreasedsignificantlyinC6cellsculturedalignantdegreebyinducingdif
4、ferentiationoftheC6cells. Keya;Differentiation 腦膠質(zhì)瘤是常見的腦腫瘤之一，由于其位置的特殊性和腫瘤本身的高侵襲性，手術(shù)難以徹底切除，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，即使聯(lián)合放化療,預(yù)后仍很差［1,2］。圣和散是我院多年來用于治療腦膠質(zhì)瘤的方藥，它能否抑制腦膠質(zhì)瘤增殖，誘導(dǎo)其分化是本實(shí)驗(yàn)研究的目的。 1材料與方法 1.1材料鼠源性膠質(zhì)細(xì)胞瘤C6細(xì)胞系（引自第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院）;DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）;甲基噻唑基四唑(MTT)、碘化丙錠（PI）、GFA
5、P單抗、免疫組化SABC試劑盒（美國(guó)Sigma公司）；c-myc單抗（英國(guó)Novo公司）;酶聯(lián)免疫儀（華東電子管廠DG5031型）。 1.2方法 1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)鼠源性膠質(zhì)細(xì)胞瘤C6細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml慶大霉素的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。2d換液1次，0.25%胰酶消化，傳代?！ ?.2.2藥物處理將中藥SHP（主要含黨參、太子參、玄參、炒白術(shù)、薏苡仁、土鱉蟲、白花蛇舌草、肉蓯蓉、蟾蜍、甘草）經(jīng)多酶乳化流程水提
6、后［3］，噴霧得干燥粉末，取適量磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解，上清用0.22μm的濾過膜過濾，配制成濃度10mg/ml的藥液?！ ?.2.3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期C6細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化,10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基配制成104個(gè)/ml單細(xì)胞懸液,取100μl(含103個(gè)細(xì)胞)加入96孔板中,培養(yǎng)4h,細(xì)胞貼壁,分為實(shí)驗(yàn)組(加SHP,終濃度分別為2.5,5,10mg/ml)和空白對(duì)照組(不加SHP),培養(yǎng)于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),72h后,加入MTT10μl/孔,繼續(xù)培養(yǎng)4h,吸去培
7、養(yǎng)液,加入DMSO100μl,將培養(yǎng)板振蕩5min,20min以內(nèi)以570nm為測(cè)試波長(zhǎng),630nm為參考波長(zhǎng),在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上讀取各孔吸光度(A值),每組8孔。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的計(jì)算：抑制率(%)=(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值×100%?！ ?.2.4免疫組化SABC染色法檢測(cè)GFAP和c-myc表達(dá)在規(guī)定培養(yǎng)時(shí)間取SHP處理組和對(duì)照組的C6細(xì)胞爬片,洗滌后經(jīng)純丙酮室溫固20～30min,蒸餾水洗;純甲醇加H2O2至0.5%,室溫浸泡30min。蒸餾水洗3次；滴加正常山羊血清封閉液,室溫20
8、min后甩去多余液體；分別滴加適當(dāng)稀釋的一抗(1∶100)GFAP(小鼠IgG)和c-myc單抗,37℃1h,0.1mol/LPBS洗2min3次;滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,37℃20min,0.1mol/LPBS洗2min3次;滴加試劑SABC,37℃20min,0.1mol/LPBS洗5min4次;室溫下DAB顯色,蒸餾水洗滌,在400倍光鏡下觀察,陽性反應(yīng)細(xì)胞核呈棕色或棕黃色。PBS代替一抗作空白對(duì)照。每張切片隨機(jī)抽
