中、重癥呼吸道合胞病毒感染小鼠模型的實(shí)驗(yàn)探究

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1、中、重癥呼吸道合胞病毒感染小鼠模型的實(shí)驗(yàn)探究.L.編輯?！菊磕康慕⒑粑篮习《?RSV)感染的中、重癥小鼠模型。方法36只小鼠分為實(shí)驗(yàn)Ⅰ組（16只）、實(shí)驗(yàn)Ⅱ組（16只）和正常對(duì)照組（4只）。采用RSV原液（TCID50為10-4.2/100μl）及100TCID50RSV液分別滴鼻感染實(shí)驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組BALB/c小鼠，于感染后第3、5、7、9d處死小鼠，進(jìn)行病毒分離，病理光鏡和電鏡檢查。結(jié)果①實(shí)驗(yàn)Ⅰ組的病毒分離陽(yáng)性率明顯高于實(shí)驗(yàn)Ⅱ組，二者相比有顯著性差異（P<0.01）；②光鏡下實(shí)驗(yàn)Ⅰ組肺泡壁明顯增厚，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，有較

2、多的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，以Ⅲ級(jí)炎癥為主；實(shí)驗(yàn)Ⅱ組病變較實(shí)驗(yàn)Ⅰ組輕，Ⅲ級(jí)炎癥面積及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)支氣管百分?jǐn)?shù)少于實(shí)驗(yàn)Ⅰ組，兩組間有顯著差異（P<0.05）。2組病變以第5d最重，第7d后開(kāi)始減輕。③電鏡下實(shí)驗(yàn)Ⅰ組可見(jiàn)肺泡Ⅰ型、Ⅱ型上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，肺泡隔水腫，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；實(shí)驗(yàn)Ⅱ組病變輕于實(shí)驗(yàn)Ⅰ組。結(jié)論用RSV原液可以成功地建立中、重癥RSV感染的動(dòng)物模型?！娟P(guān)鍵詞】呼吸道合胞病毒；模型呼吸道合胞病毒（RSV）是2歲以下嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎和病毒性肺炎的主要病原之一，病情嚴(yán)重者可發(fā)生呼吸衰竭，甚至死亡。

3、但是到目前為止，尚無(wú)用于RSV感染的特效藥，而且其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，因此亟須建立一個(gè)中、重癥RSV感染動(dòng)物模型，以研究RSV感染導(dǎo)致的疾病。本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的RSV液感染小鼠，以期獲得一個(gè)中、重癥RSV感染模型。1材料和方法1.1材料RSVLong株及人喉癌上皮細(xì)胞系（Hep-2細(xì)胞），購(gòu)自北京兒科研究所。清潔級(jí)近交系BALB/c雌性小鼠36只，6～8周齡，體重20±2g，由解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2方法1.2.1病毒毒力滴定將RSV-Long株滴入生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單層Hep-2細(xì)胞（細(xì)胞濃度1×105）中，發(fā)生細(xì)胞

4、病變后連傳3代，在細(xì)胞融合病變最明顯時(shí)，用力振蕩細(xì)胞瓶，使細(xì)胞從瓶壁脫落，反復(fù)凍融3次，4℃離心，去除細(xì)胞散片，取上清液，采用Reed-Muench微量法滴定病毒效價(jià)，-30°C保存，用于動(dòng)物接種。1.2.2動(dòng)物模型的建立36只小鼠分為3組：實(shí)驗(yàn)Ⅰ組、實(shí)驗(yàn)Ⅱ組每組16只，正常對(duì)照組4只。用乙醚完全麻醉后，實(shí)驗(yàn)Ⅰ組經(jīng)鼻緩慢滴入RSV原液（TCID50為10-4.2/100μl），實(shí)驗(yàn)Ⅱ組經(jīng)鼻緩慢滴入100TCID50RSV液，每側(cè)鼻孔各0.1ml；對(duì)照組每側(cè)鼻孔給予0.1ml的1640維持液。1.2.3標(biāo)本的采集于感染后第3、5、7、9

5、d處死小鼠。無(wú)菌條件下取出肺組織，左肺一部分用10％中性福爾馬林固定，石蠟包埋制成切片，作HE染色觀察肺組織病理改變，另一部分用4％戊二醛固定，用于透射電子顯微鏡下觀察肺組織超微結(jié)構(gòu)的改變；右肺置于滅菌Hank’s液中，用于病毒分離。1.2.4肺組織病毒分離無(wú)菌條件下取出的肺組織稱重后用hank’s液洗2次，按10ml/g加入Eagle液，剪碎新鮮的肺組織標(biāo)本，研磨后離心5min，收集上清，接種到Hep-2細(xì)胞中，觀察細(xì)胞病變，待細(xì)胞融合病變“++”時(shí)，記錄結(jié)果。1.2.5光鏡標(biāo)本結(jié)果判定及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理做肺橫切面連續(xù)切片，每隔100μｍ

6、取切片1張，共取3張。置網(wǎng)格目鏡測(cè)微尺在400倍鏡下，每張切片取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)切片上肺泡炎0～Ⅳ級(jí)方格數(shù)及每張切片內(nèi)全部支氣管數(shù)和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的支氣管數(shù)，數(shù)據(jù)取3張切片的均數(shù)。參照Szapiel［1］提供的肺泡炎分級(jí)，0～Ⅳ級(jí)病變確定如下：0級(jí)為無(wú)肺泡炎；Ⅰ級(jí)為肺泡壁間質(zhì)水腫，毛細(xì)血管充血致肺泡壁輕度增厚；Ⅱ級(jí)為肺泡壁中度增厚，肺泡腔變小；Ⅲ級(jí)為肺泡壁重度增厚，肺泡腔狹小或膨大；Ⅳ級(jí)為肺實(shí)變。計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用方差分析。2結(jié)果2.1病毒效價(jià)：在96孔板中滴定病毒效價(jià)為104TCID50。2.2肺組織病毒分離：實(shí)驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組

7、第5d病毒分離陽(yáng)性率分別為83.3％、66.8％，第7d分別為62.5％、40.5％，第5、7d實(shí)驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組病毒分離陽(yáng)性率相比分別有顯著差異（P<0.01）。2.3病理檢查結(jié)果2.3.1實(shí)驗(yàn)Ⅰ組光鏡下肺泡出現(xiàn)典型的間質(zhì)性肺炎表現(xiàn)，肺泡壁明顯增厚，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，有較多的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔明顯狹窄（見(jiàn)封四圖1），病變以感染后第5d最顯著，此時(shí)Ⅲ級(jí)炎癥占絕大多數(shù)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)支氣管數(shù)接近全部，第7d炎癥開(kāi)始減輕，第9d炎癥明顯好轉(zhuǎn)，以Ⅰ、Ⅱ級(jí)炎癥為主，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)支氣管數(shù)明顯減少，與實(shí)驗(yàn)Ⅱ組相比有顯著差異（P<0.05）。

8、見(jiàn)表1。電鏡下可見(jiàn)肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞腫脹（見(jiàn)封四圖2），形成水泡樣，并壞死或脫落；肺泡隔有水腫，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，形成大小不等的囊泡，有的形成窗隔樣裂隙，在病變嚴(yán)重的肺泡腔內(nèi)，可見(jiàn)