中、重癥呼吸道合胞病毒感染小鼠模型的實驗探究

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1、中、重癥呼吸道合胞病毒感染小鼠模型的實驗探究【摘要】目的建立呼吸道合胞病毒(RSV)感染的中、重癥小鼠模型。方法36只小鼠分為實驗Ⅰ組（16只）、實驗Ⅱ組（16只）和正常對照組（4只）。采用RSV原液（TCID50為10-4.2/100μl）及100TCID50RSV液分別滴鼻感染實驗Ⅰ、Ⅱ組BALB/c小鼠，于感染后第3、5、7、9d處死小鼠，進行病毒分離，病理光鏡和電鏡檢查。結果①實驗Ⅰ組的病毒分離陽性率明顯高于實驗Ⅱ組，二者相比有顯著性差異（P0.01）；②光鏡下實驗Ⅰ組肺泡壁明顯增厚，毛細血管擴張充血，有較多的淋巴細胞浸潤，以Ⅲ級炎癥為主；實驗Ⅱ組病變較實驗Ⅰ組

2、輕，Ⅲ級炎癥面積及炎性細胞浸潤支氣管百分數(shù)少于實驗Ⅰ組，兩組間有顯著差異（P0.05）。2組病變以第5d最重，第7d后開始減輕。③電鏡下實驗Ⅰ組可見肺泡Ⅰ型、Ⅱ型上皮細胞及毛細血管內皮細胞腫脹，肺泡隔水腫，淋巴細胞、單核細胞和嗜酸性粒細胞浸潤；實驗Ⅱ組病變輕于實驗Ⅰ組。結論用RSV原液可以成功地建立中、重癥RSV感染的動物模型。【關鍵詞】呼吸道合胞病毒；模型呼吸道合胞病毒（RSV）是2歲以下嬰幼兒毛細支氣管炎和病毒性肺炎的主要病原之一，病情嚴重者可發(fā)生呼吸衰竭，甚至死亡。但是到目前為止，尚無用于RSV感染的特效藥，而且其發(fā)病機制尚不清楚，因此亟須建立一個中、重癥RSV感

3、染動物模型，以研究RSV感染導致的疾病。本實驗采用不同濃度的RSV液感染小鼠，以期獲得一個中、重癥RSV感染模型。1材料和方法1.1材料RSVLong株及人喉癌上皮細胞系（Hep-2細胞），購自北京兒科研究所。清潔級近交系BALB/c雌性小鼠36只，6～8周齡，體重20±2g，由解放軍第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。1.2方法1.2.1病毒毒力滴定將RSV-Long株滴入生長狀態(tài)良好的單層Hep-2細胞（細胞濃度1×105）中，發(fā)生細胞病變后連傳3代，在細胞融合病變最明顯時，用力振蕩細胞瓶，使細胞從瓶壁脫落，反復凍融3次，4℃離心，去除細胞散片，取上清液，采用Reed-

4、Muench微量法滴定病毒效價，-30°C保存，用于動物接種。1.2.2動物模型的建立36只小鼠分為3組：實驗Ⅰ組、實驗Ⅱ組每組16只，正常對照組4只。用乙醚完全麻醉后，實驗Ⅰ組經(jīng)鼻緩慢滴入RSV原液（TCID50為10-4.2/100μl），實驗Ⅱ組經(jīng)鼻緩慢滴入100TCID50RSV液，每側鼻孔各0.1ml；對照組每側鼻孔給予0.1ml的1640維持液。1.2.3標本的采集于感染后第3、5、7、9d處死小鼠。無菌條件下取出肺組織，左肺一部分用10％中性福爾馬林固定，石蠟包埋制成切片，作HE染色觀察肺組織病理改變，另一部分用4％戊二醛固定，用于透射電子顯微鏡下觀察肺組

5、織超微結構的改變；右肺置于滅菌Hank’s液中，用于病毒分離。1.2.4肺組織病毒分離無菌條件下取出的肺組織稱重后用hank’s液洗2次，按10ml/g加入Eagle液，剪碎新鮮的肺組織標本，研磨后離心5min，收集上清，接種到Hep-2細胞中，觀察細胞病變，待細胞融合病變“++”時，記錄結果。1.2.5光鏡標本結果判定及統(tǒng)計學處理做肺橫切面連續(xù)切片，每隔100μｍ取切片1張，共取3張。置網(wǎng)格目鏡測微尺在400倍鏡下，每張切片取10個視野，計數(shù)切片上肺泡炎0～Ⅳ級方格數(shù)及每張切片內全部支氣管數(shù)和炎性細胞浸潤的支氣管數(shù)，數(shù)據(jù)取3張切片的均數(shù)。參照Szapiel〔1〕提供的

6、肺泡炎分級，0～Ⅳ級病變確定如下：0級為無肺泡炎；Ⅰ級為肺泡壁間質水腫，毛細血管充血致肺泡壁輕度增厚；Ⅱ級為肺泡壁中度增厚，肺泡腔變??；Ⅲ級為肺泡壁重度增厚，肺泡腔狹小或膨大；Ⅳ級為肺實變。計數(shù)資料用率表示，組間比較采用方差分析。2結果2.1病毒效價：在96孔板中滴定病毒效價為104TCID50。2.2肺組織病毒分離：實驗Ⅰ、Ⅱ組第5d病毒分離陽性率分別為83.3％、66.8％，第7d分別為62.5％、40.5％，第5、7d實驗Ⅰ、Ⅱ組病毒分離陽性率相比分別有顯著差異（P0.01）。2.3病理檢查結果2.3.1實驗Ⅰ組光鏡下肺泡出現(xiàn)典型的間質性肺炎表現(xiàn)，肺泡壁明顯增厚，

7、毛細血管擴張充血，有較多的淋巴細胞浸潤，肺泡腔明顯狹窄（見封四圖1），病變以感染后第5d最顯著，此時Ⅲ級炎癥占絕大多數(shù)，炎性細胞浸潤支氣管數(shù)接近全部，第7d炎癥開始減輕，第9d炎癥明顯好轉，以Ⅰ、Ⅱ級炎癥為主，炎性細胞浸潤支氣管數(shù)明顯減少，與實驗Ⅱ組相比有顯著差異（P0.05）。見表1。電鏡下可見肺泡Ⅰ型上皮細胞腫脹（見封四圖2），形成水泡樣，并壞死或脫落；肺泡隔有水腫，淋巴細胞、單核細胞和嗜酸性粒細胞浸潤；毛細血管內皮細胞腫脹，形成大小不等的囊泡，有的形成窗隔樣裂隙，在病變嚴重的肺泡腔內，可見富含蛋白的滲液，各種炎癥細胞和紅細胞；肺泡Ⅱ