e7蛋白檢測(cè)技術(shù)在宮頸癌早期篩查中的應(yīng)用

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1、E7蛋白檢測(cè)技術(shù)在宮頸癌早期篩查中的應(yīng)用刖§宮頸癌是中國(guó)女性第二大最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是發(fā)展中國(guó)家女性癌癥死亡的主要原因。我國(guó)每年新增宮頸癌病人13萬(wàn)多，每年約有5萬(wàn)人死于宮頸癌，且發(fā)病年齡明顯趨于年輕化，35歲以下的宮頸癌病例出現(xiàn)上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害婦女健康，因此宮頸癌的篩查和預(yù)防具有重要意義。宮頸癌的發(fā)展一般需要10年左右時(shí)間，在這期間，若能及早發(fā)現(xiàn)癌前病變，就可以有效預(yù)防癌癥的發(fā)生?！?015年美國(guó)癌癥篩查指南》推薦：1)21-29歲女性，應(yīng)單獨(dú)進(jìn)行宮頸細(xì)胞學(xué)檢查，每3年1次；2)30-65歲女性，優(yōu)先推薦細(xì)

2、胞學(xué)和HPV聯(lián)合篩查，每5年1次，也可每3年1次細(xì)胞學(xué)篩查；3)對(duì)于前10年內(nèi)細(xì)胞學(xué)檢測(cè)連續(xù)3次陰性或細(xì)胞學(xué)和HPV聯(lián)合篩查連續(xù)2次陰性且最后一次篩查在5年內(nèi)的女性，65歲后應(yīng)停止任何方式的篩查；1)任何年齡段都不需要通過(guò)任何方式每年篩查。冃前臨床常用的宮頸癌篩查方法包括：傳統(tǒng)的巴氏細(xì)胞學(xué)檢測(cè)、液基薄層細(xì)胞涂片、HPVDNA分子檢測(cè)等。近年來(lái)，宮頸癌篩查出現(xiàn)了一系列新技術(shù)包括：HPVmRNA檢測(cè)、〃替代性生物標(biāo)志物〃(surrogatemarker)檢測(cè)等。E7癌蛋白的表達(dá)和功能是宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的重要條件大量研

3、究發(fā)現(xiàn)，人乳頭瘤病毒(Humanpapillomaviruses,HPV)與宮頸癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，是所有宮頸鱗狀細(xì)胞癌(SCC)和大部分宮頸腺癌的致癌病原體。目前已經(jīng)有200多種的HPV亞型被鑒定⑴,根據(jù)其致癌性分為高危型HPV(hrHPV)和低危型HPV(IrHPV),其中14種主要高危型HPV與宮頸癌的發(fā)生和演變有關(guān)。雖然HPV感染的人群比例很大，但HPV感染不等于宮頸癌，一過(guò)性的陽(yáng)性攜帶者中80%以上在6到12個(gè)月內(nèi)會(huì)自然清除，只有很少一部分會(huì)進(jìn)展到宮頸病變或癌癥。持續(xù)性的hrHPV感染，使病毒基因得以整

4、合到人體細(xì)胞基因組內(nèi)，啟動(dòng)病毒致癌基因E6,E7蛋白表達(dá)。E6,E7蛋白被證明是驅(qū)動(dòng)宮頸癌發(fā)展的主要致癌因子23］o高表達(dá)的E7蛋口與Rb結(jié)合使Rb-E2F復(fù)合物解離，E2F從pRb蛋口中釋放,Rb通路失控，反饋刺激pl6INK4A、Ki67、細(xì)胞周期蛋白A(CyclinA)和細(xì)胞周期蛋白E(CyclinE)等在內(nèi)的眾多細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá),使宮頸上皮細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生紊亂。因此，"E7蛋白表達(dá)是維持宮頸癌及其高級(jí)別癌前病變發(fā)展必需的?！ㄒ灰籈7蛋白表達(dá)與宮頸癌發(fā)展存在因果關(guān)系。細(xì)胞學(xué)診斷技術(shù)進(jìn)展自Papani

5、colaou發(fā)明巴氏涂片法以來(lái)，巴氏涂片細(xì)胞學(xué)檢查作為宮頸癌的篩查方法已有70多年的歷史，作為笫一代細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)巴氏圖片的假陰性率在50%以上；而本世紀(jì)初以液基細(xì)胞學(xué)(liquidbasedcytology)為代表的第二代細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)改善了樣本的制片質(zhì)量，但檢測(cè)靈敏度在50-70%之間仍不能滿(mǎn)足臨床需求；以免疫細(xì)胞學(xué)(immuno-cytology)為代表的第三代細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)，代表性產(chǎn)品為羅氏的CINtecPLUS(pl6INK4A/Ki67雙染)，據(jù)PALMS研究報(bào)道，P16INK4A/KI67的靈敏度能

6、夠達(dá)到85%以上［4］。這些替代性的蛋白標(biāo)志物在正常宮頸細(xì)胞中也有內(nèi)源性表達(dá)，由此影響了它們?cè)趯m頸癌診斷方而的應(yīng)用。而僅在高危型HPV轉(zhuǎn)化的宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)的E7癌蛋白無(wú)疑是宮頸癌早期診斷的理想標(biāo)志物⑸。1514345468829037576.jpg圖1細(xì)胞學(xué)診斷技術(shù)發(fā)展三階段E7蛋白標(biāo)志物在細(xì)胞學(xué)上的應(yīng)用E7?ICC是針對(duì)宮頸上皮脫落細(xì)胞中來(lái)自于HPV基因編碼的E7癌蛋白表達(dá)的臨床檢測(cè)新方法，通過(guò)使用E7單克隆抗體，能夠特異性識(shí)別表達(dá)E7蛋白的癌變細(xì)胞（試驗(yàn)操作過(guò)程如圖2所示）。檢測(cè)結(jié)果在細(xì)胞樣本中出現(xiàn)明顯的棕

7、色胞質(zhì)染色，即可認(rèn)為該細(xì)胞為E7-ICC陽(yáng)性染色。（臨床實(shí)驗(yàn)室2016年第9期）。1514345499594036889.jpg圖2E7-ICC技術(shù)試驗(yàn)程序采用的液基細(xì)胞學(xué)制片技術(shù)評(píng)估E7-ICC技術(shù)的臨床應(yīng)用。圖3中陽(yáng)性對(duì)照采用高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）的臨床樣本，陰性對(duì)照為未見(jiàn)上皮內(nèi)病變（NILM）的正常宮頸上皮細(xì)胞臨床樣本。結(jié)果如圖所示：在表達(dá)E7蛋白的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中呈現(xiàn)棕色染色，且定位于形態(tài)學(xué)為HSIL的細(xì)胞中（圖3A,C）；而在NILM的樣本中未檢測(cè)到E7單抗的染色。值得注意的是，E7癌蛋片是否表達(dá)可

8、以用來(lái)評(píng)估LBC報(bào)告（如HSIL,LSIL和ASC-US等）中不同級(jí)別宮頸損傷程度的惡變傾向，證明了使用特定的生物標(biāo)志物解釋細(xì)胞學(xué)結(jié)果的可行性。這對(duì)于細(xì)胞形態(tài)學(xué)某些不確定病例的分流是非常有必要的，例如ASC-USo如圖3E所示：該病例傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)報(bào)告為ASC-US,在癌前病變細(xì)胞中檢測(cè)除了E7癌蛋白的表達(dá)。另外，E7-ICC檢測(cè)技術(shù)與目前市場(chǎng)上絕大部分的國(guó)產(chǎn)（安必平、泰普、