內(nèi)體酸化成熟障礙對(duì)lps活化巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用及機(jī)制研究

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1、第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文內(nèi)體酸化成熟障礙對(duì)LPS活化巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用及機(jī)制研究姓名：楊洋申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)指導(dǎo)教師：鄭江201205第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文內(nèi)體酸化成熟障礙對(duì)LPS活化巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用及機(jī)制研究摘要膿毒癥(sepsis)是由感染因素引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)，是嚴(yán)重?zé)齻?、?chuàng)傷的常見(jiàn)并發(fā)癥，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致多器官功能障礙綜合癥(multipleorgandysfuctionsyndrome，MODS

2、)和膿毒性休克(septicshock)，嚴(yán)重威脅患者生命。革蘭陰性菌外膜中的主要成分內(nèi)毒素(Lipop01ysaccharide，LPS)是膿毒癥的主要病原體相關(guān)分子模式(pathogen—associatedmolecularpatterns，PAMPs)。LPS與其模式識(shí)別受體TLR4(Tolllikereceptor4)結(jié)合后可啟動(dòng)MyD88依賴和TRIF／TRAM依賴的兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，活化單核／巨噬細(xì)胞，激活炎癥因子的轉(zhuǎn)錄與釋放，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，過(guò)度的炎癥反應(yīng)可誘導(dǎo)膿毒癥的發(fā)生。內(nèi)化(internalizat

3、ion)是指細(xì)胞通過(guò)胞吞作用將胞外物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)入胞內(nèi)的過(guò)程。LPS—TLR4復(fù)合物內(nèi)化入胞進(jìn)入早期內(nèi)體，然后通過(guò)晚期內(nèi)體運(yùn)送至溶酶體降解代謝，這一過(guò)程伴隨著內(nèi)體的酸化成熟。近期研究表明，LPS的內(nèi)化與其對(duì)細(xì)胞的活化密切相關(guān)，本課題組前期研究結(jié)果也顯示，內(nèi)化抑制后，LPS刺激巨噬細(xì)胞活化的程度明顯降低；內(nèi)體酸化成熟障礙可抑制巨噬細(xì)胞的活化，對(duì)炎癥反應(yīng)具有抑制作用，但機(jī)制尚不明確。同時(shí)還觀察到CQ預(yù)處理抑制內(nèi)體酸化成熟后內(nèi)化的LPS—TLR4共定位消失，這與以往的認(rèn)知相悖，而這一現(xiàn)象與LPS內(nèi)化和活化細(xì)胞的關(guān)系及機(jī)制不明確。因

4、此，本研究旨在探討內(nèi)體酸化成熟障礙對(duì)LPS活化巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用及機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究LPS內(nèi)化與細(xì)胞活化的關(guān)系及病理生理機(jī)制奠定基礎(chǔ)。目的應(yīng)用內(nèi)體酸化成熟抑制劑氯喹(Chloroquine，CQ)抑制RAW264．7細(xì)胞內(nèi)體酸化成熟，研究?jī)?nèi)體酸化成熟障礙對(duì)LPS活化巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用及機(jī)制。方法1．內(nèi)體酸化成熟障礙對(duì)LPS活化RAW264．7細(xì)胞的調(diào)控作用的研究(1)CQ(20I，tg／m1)預(yù)處理RAW264．7細(xì)胞lh，LPS(100ng／m1)束lJ激24h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，ELISA法檢測(cè)TNF．a(chǎn)和I

5、L一6在蛋白水平的表達(dá)情況。(2)采用siRNA技術(shù)抑制RAW264．7細(xì)胞MyD88、TRAM的表達(dá)，LPS(100ng／m1)第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文刺激24h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，ELISA法檢測(cè)TNF一0【和IL一6蛋白水平的表達(dá)情況。(3)小鼠炎癥細(xì)胞因子抗體芯片技術(shù)檢測(cè)CQ預(yù)處理及siRNA干擾MyD88、TRAM后細(xì)胞上清中炎癥介質(zhì)總體的分泌情況，并進(jìn)行對(duì)比分析。2．內(nèi)體酸化成熟障礙對(duì)LPS活化RAW264．7細(xì)胞的調(diào)控作用的機(jī)制研究(1)CQ預(yù)處理后LPS—TLR4復(fù)合物共定位消失現(xiàn)象的研究①利用CQ(

6、20I．tg／m1)及另一內(nèi)體酸化成熟抑制劑一氯化銨(5001xg／m1)抑制RAW264．7細(xì)胞內(nèi)體酸化成熟，F(xiàn)ITC—LPS(200ng／m1)束lJ激lh，激光共聚焦顯微鏡觀察FITC—LPS與Cy3一TLR4在胞內(nèi)的共定位情況。②cQ(20pg／IIll)抑制RAW264．7細(xì)胞內(nèi)體酸化成熟后，6FAM—CpGDNA(100ng／m1)刺激30min，激光共聚焦顯微鏡觀察6FAM．CpGDNA與Cy5．TLR9在胞內(nèi)的共定位情況。③動(dòng)態(tài)觀察內(nèi)體酸化成熟障礙后LPS與TLR4在胞內(nèi)的共定位情況TLR4：：YFP標(biāo)

7、記質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡觀察。CQ預(yù)處理后于不同時(shí)相點(diǎn)觀察LPS—TLR4的胞內(nèi)分布情況。④內(nèi)體酸化成熟障礙對(duì)內(nèi)體循環(huán)相關(guān)調(diào)控分子表達(dá)的影響LPS(100ng／m1)束lJ激CQ(20／．tg／m1)預(yù)處理1h后的RAW264．7細(xì)胞，4h后，提取細(xì)胞總RNA，RealtimePCR法檢測(cè)內(nèi)體循環(huán)關(guān)鍵分子Rab7b、Rabl0、Rablla在核酸水平的表達(dá)情況。(2)內(nèi)體酸化成熟障礙對(duì)炎癥負(fù)調(diào)控分子表達(dá)的影響LVS(100ng／m1)*U激CQ預(yù)處理1h后的RAW264．7細(xì)胞，4h后，提取細(xì)胞總R

8、NA，RealtimePCR法檢測(cè)負(fù)調(diào)控分子A20、Tollip及MyD88s在核酸水平的表達(dá)情況。結(jié)果1．內(nèi)體酸化成熟障礙對(duì)LPS活化RAW264．7細(xì)胞的調(diào)控作用的研究(1)CQ預(yù)處理lh，LPS刺激后TNF—a和IL一6蛋白水平的表達(dá)被顯著抑制。(2)siRNA技術(shù)抑制RAW264．7細(xì)胞MyD88、TRAM的表達(dá)后，TNF