小鼠巨噬細(xì)胞ana-1的誘導(dǎo)分化及其不同分型在葉酸性腎病中的作用

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1、碩士學(xué)位論文論文題目小鼠巨噬細(xì)胞ANA-1的誘導(dǎo)分化及其不同分型在葉酸性腎病中的作用研究生姓名李迪指導(dǎo)教師姓名李曉忠教授專業(yè)名稱兒科學(xué)研究方向腎臟免疫論文提交日期2013年3月小鼠巨噬細(xì)胞ANA-1的誘導(dǎo)分化及其不同分型在葉酸性腎病中的作用中文摘要小鼠巨噬細(xì)胞ANA-1的誘導(dǎo)分化及其不同分型在葉酸性腎病中的作用中文摘要研究背景：近年來不同活化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞在腎間質(zhì)纖維化發(fā)展過程中的不同作用受到愈來愈多的重視。各種因素引起腎臟損傷時(shí)，循環(huán)中的巨噬細(xì)胞浸潤到腎臟，根據(jù)組織微環(huán)境的不同，活化為M1型的巨噬細(xì)胞促進(jìn)腎臟炎癥發(fā)展，M2型巨

2、噬細(xì)胞釋放IL-4、IL-13、IL-10等調(diào)節(jié)因子促進(jìn)組織炎癥向組織恢復(fù)方向發(fā)展。目前誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型分化的分子較多，但共刺激分子特別是在免疫炎癥反應(yīng)中起重要作用的B7-H3分子以及不同表型巨噬細(xì)胞在腎小管間質(zhì)纖維化中的作用研究較少。目的：本實(shí)驗(yàn)使用不同方法刺激小鼠巨噬細(xì)胞ANA-1誘導(dǎo)出不同表型巨噬細(xì)胞，比較不同條件刺激下各表型巨噬細(xì)胞表達(dá)蛋白及分泌因子的差異，建立起ANA-1的表型分化體系，同時(shí)研究B7-H3對ANA-1表型的影響，為B7-H3的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。此外，應(yīng)用脂多糖（LPS）或IL-4分別刺激的ANA-1

3、輸入到小鼠體內(nèi)，觀察不同條件刺激下的巨噬細(xì)胞對小鼠腎小管間質(zhì)纖維化的影響。方法:1.在1640和FBS培養(yǎng)ANA-1巨噬細(xì)胞的過程中，分別加用LPS、IL-4、B7-H3單克隆抗體（簡稱B7-H3mAb）、B7-H3mAb+LPS、B7-H3mAb+IL-4，同時(shí)設(shè)立空白對照組、小鼠IgG對照組，培養(yǎng)24小時(shí)后收取細(xì)胞及上清液，流式細(xì)胞術(shù)檢測誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)、巨噬細(xì)胞甘露糖受體（CD206）的蛋白表達(dá)水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測細(xì)胞上清液IL-10、TNF-α的表達(dá)。2.采用兩次腹腔注射葉酸的方法建立

4、腎小管間質(zhì)纖維化模型，CD1小鼠隨機(jī)分為正常對照組、葉酸組、LPS+葉酸組、IL-4+葉酸組，分別于第14天和21天處死小鼠，留取血標(biāo)本測肌酐（Cr）、尿素(UN)、尿酸(UA)水平，摘取右腎行常規(guī)HE染色、MASSON染色及F4/80巨噬細(xì)胞、ɑ平滑肌肌動(dòng)蛋白（ɑ-SMA）、膠原蛋白I（COLI）免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果：第一部分：1.ANA-1經(jīng)LPS刺激24h后B7-H3的表達(dá)升高，而IL-4刺激24hI中文摘要小鼠巨噬細(xì)胞ANA-1的誘導(dǎo)分化及其不同分型在葉酸性腎病中的作用后的B7-H3的表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<

5、0.05）；2.與空白對照組相比，LPS組高表達(dá)iNOS，加入B7-H3mAb后iNOS的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；3.CD206在各組均高表達(dá)；4.與空白對照組相比，IL-4組及IL-4+B7-H3mAb組產(chǎn)生的IL-10明顯增加（P<0.05），LPS組、B7-H3mAb組和LPS+B7-H3mAb組則無明顯差別；TNF-α的水平與空白對照組相比IL-4+B7-H3mAb組雖有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但變化不大，其他五組與空白對照組相比無明顯差異。第二部分：1.HE染色和Masson染色顯示正常對照組腎臟正常，葉酸

6、組、LPS+葉酸組、IL-4+葉酸組小鼠UN、Cr、UA明顯升高，腎小管間質(zhì)纖維化，腎損傷嚴(yán)重程度LPS+葉酸組最重，葉酸組次之，IL-4+葉酸組最輕。2.免疫組織化學(xué)結(jié)果：兩周時(shí)葉酸組、LPS+葉酸組、IL-4+葉酸組可見F4/80+巨噬細(xì)胞浸潤，ɑ-SMA和COLI的表達(dá)量均明顯高于正常對照組（P<0.05），模型組間無明顯差別；三周時(shí)，ɑ-SMA的表達(dá)在IL-4+葉酸組明顯低于LPS+葉酸組和葉酸組(P<0.05)，COLI的表達(dá)，LPS+葉酸組最高，葉酸組次之，IL-4+葉酸組最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論

7、：第一部分：1.1μg/mlLPS刺激ANA-1上調(diào)iNOS的水平，向M1型巨噬細(xì)胞極化并上調(diào)B7-H3的表達(dá)，B7-H3mAb下調(diào)LPS活化的ANA-1iNOS的表達(dá)。2.10ng/mlIL-4刺激ANA-1下調(diào)B7-H3的表達(dá)，并促進(jìn)IL-10的分泌，向M2型巨噬細(xì)胞極化。第二部分：1.兩次240mg/kg葉酸腹腔注射后，葉酸組小鼠腎臟腎小管間質(zhì)明顯纖維化，免疫組織化學(xué)示腎間質(zhì)F4/80+巨噬細(xì)胞數(shù)量、COLⅠ及ɑ-SMA明顯增加，該方法成功建立腎小管間質(zhì)纖維化模型。2.LPS和IL-4分別誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞輸入到葉酸性腎病小鼠

8、體內(nèi)，LPS刺激的巨噬細(xì)胞明顯加重葉酸性腎病小鼠腎小管間質(zhì)的損傷，具體表現(xiàn)為腎小管間質(zhì)COLⅠ的產(chǎn)生和小管間質(zhì)纖維化的面積明顯增加；而IL-4活化的M2型巨噬細(xì)胞抑制葉酸性腎病小鼠腎小管間質(zhì)纖維化，具體表現(xiàn)在腎小管間質(zhì)COLⅠ及ɑ-SMA的產(chǎn)生以及小管間質(zhì)纖維化