雷帕霉素對(duì)大鼠脊髓損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

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1、雷帕霉素對(duì)大鼠脊髓損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究ProtectivenessofRapamycinonSpinalCordInjuriesofRatsandItsRelativeMechanisms作者姓名：宋宇專業(yè)名稱：人體解剖與組織胚胎學(xué)研究方向：干細(xì)胞與組織工程指導(dǎo)教師：陳東教授學(xué)位類別：醫(yī)學(xué)博士培養(yǎng)單位：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院論文答辯日期：20156年月3日授予學(xué)位日期：年月日論文評(píng)閱人：答辯委員會(huì)組成：姓名職稱工作單位姓名職稱工作單位李和教授華中科技大學(xué)主席賈繼輝教授山東大學(xué)周德山教授首都醫(yī)科大學(xué)委員李曉萌教授東北師范大學(xué)劉慧雯教授哈爾濱醫(yī)科大學(xué)李凡教授吉林大學(xué)盲審專家教授趙華教授吉林大學(xué)盲審專家研究

2、員陳立教授吉林大學(xué)中文摘要脊髓損傷（spinalcordinjury,SCI）的病理過(guò)程包括原發(fā)性和繼發(fā)性損傷，前者指暴力發(fā)生時(shí)脊髓的不可逆性損傷，后者是在此基礎(chǔ)上發(fā)生的局部缺血、水腫、電解質(zhì)紊亂等一系列生理生化反應(yīng)。缺血缺氧和炎癥反應(yīng)均能引起活性氧(reactiveoxgenspecieces，ROS)的產(chǎn)生和釋放，ROS大量堆積導(dǎo)致局部組織氧化損傷，神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死。尋找有效藥物減少脊髓神經(jīng)元繼發(fā)性死亡，一直以來(lái)都是人們研究的熱點(diǎn)。雷帕霉素（Rapamycin,Rap）是腎移植術(shù)后抗排斥反應(yīng)藥物，是一種高效的免疫抑制劑。近期發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素又具有上調(diào)自噬的作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病研

3、究顯示，雷帕霉素會(huì)隨動(dòng)物種類和疾病模型不同而發(fā)揮截然相反的作用，脊髓損傷時(shí)，雷帕霉素是否具有神經(jīng)保護(hù)作用，目前尚無(wú)定論。本研究建立大鼠脊髓損傷模型，觀察雷帕霉素對(duì)損傷脊髓是否具有保護(hù)作用；選擇H2O2氧化損傷PC12細(xì)胞模型，進(jìn)一步探討雷帕霉素對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制，通過(guò)NF-kB和NLRP3炎癥小體表達(dá)情況，初步探索自噬和炎癥之間相互作用的關(guān)系，論文分以下兩部分闡述。第一部分雷帕霉素對(duì)脊髓撞擊損傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用目的：建立大鼠脊髓損傷模型，觀察雷帕霉素是否具有上調(diào)自噬、下調(diào)炎癥以及抑制凋亡的神經(jīng)保護(hù)作用。方法：Wistar雌性大鼠45只。開椎板假手術(shù)組3只，42只大鼠制備脊髓撞擊損傷模型

4、，隨機(jī)分成雷帕霉素治療組和損傷對(duì)照組。術(shù)后3d、7d、14d取材，進(jìn)行H-E染色、ED-1染色、GFAP免疫熒光染色，觀察脊髓損傷病理學(xué)變化；酶組織化學(xué)法檢測(cè)組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)濃度；Westernblot法檢測(cè)炎性因子TNF-α、IL-1β、自噬相關(guān)蛋白Beclin-1的表達(dá)；TUNEL法檢測(cè)脊髓組織細(xì)胞凋亡指數(shù)；NF免疫組化染色觀察脊髓組織中存活神經(jīng)元。結(jié)果：成功建立大鼠脊髓撞擊損傷模型，術(shù)后3d雷帕霉素治療組MPO值I低于損傷組(P<0.05)，Westernblot結(jié)果顯示雷帕霉素組炎性因子IL-lβ，TNF-α表達(dá)低于損傷組(P<0.05)，自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達(dá)高于

5、損傷組。術(shù)后7dED-1陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞在雷帕霉素組明顯少于損傷對(duì)照組(P<0.05)，術(shù)后14dGFAP熒光染色陽(yáng)性星型膠質(zhì)細(xì)胞，雷帕霉素組有減少趨勢(shì)，但與損傷組之間無(wú)顯著性差異。H-E染色結(jié)果顯示，在損傷區(qū)與正常脊髓交界處，損傷組炎癥細(xì)胞數(shù)目較多。TUNEL結(jié)果顯示，雷帕霉素組凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P<0.05)。NF染色顯示，雷帕霉素組神經(jīng)元數(shù)目明顯多于單純損傷組(P<0.05)。結(jié)論：雷帕霉素作用于大鼠脊髓撞擊損傷，不僅可以上調(diào)自噬；而且能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化和增殖、減少中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，減少炎性因子表達(dá)，減輕了神經(jīng)組織繼發(fā)性炎癥反應(yīng)；雷帕霉素最終減少凋亡細(xì)胞數(shù)量，增加神經(jīng)元存活

6、，對(duì)損傷脊髓具有保護(hù)作用。關(guān)鍵詞：脊髓損傷；雷帕霉素；自噬；炎癥；凋亡；大鼠第二部分雷帕霉素對(duì)氧化應(yīng)激損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制研究目的：觀察雷帕霉素預(yù)處理對(duì)氧化應(yīng)激損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用，從自噬和炎癥之間的關(guān)聯(lián)信號(hào)通路探討雷帕霉素保護(hù)作用的機(jī)制。方法：實(shí)驗(yàn)共分五組：正常PC12細(xì)胞組；H2O2+PC12組；RAP+H2O2+PC12組；RAP+SN50+H2O2+PC12組；3-MA+H2O2+PC12組，制備H2O2氧化損傷PC12細(xì)胞模型。MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率；光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；MDC染色觀察細(xì)胞自噬囊泡變化；ROS染色觀察細(xì)胞活性氧變化；ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)

7、上清和細(xì)胞內(nèi)炎性因子TNF-α、IL-1β變化；Westernblot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3，促凋亡蛋白Bax、Cleave-caspase3，炎癥信號(hào)通路NF-kB、炎癥小體NLRP3、炎性因子IL-1β表達(dá)變化。結(jié)果：200μMH2O2處理PC12細(xì)胞24h，成功構(gòu)建氧化損傷細(xì)胞模型。MTT法結(jié)果提示Rap和Rap+SN50組與H2O2組比較，細(xì)胞存活率增加；3-MA組與H