肽核酸在杜興肌肉萎縮癥治療中的應(yīng)用研究

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1、分類號(hào)：R966學(xué)校代碼：10062密級(jí)：學(xué)號(hào)：2011601079博士學(xué)位論文DOCTORALDISSERTATION論文題目：肽核酸在杜興肌肉萎縮癥治療中的應(yīng)用研究TITLEInvestigationofPeptideNucleicAcidinDuchennemusculardystrophydiseasemodel一級(jí)學(xué)科：藥學(xué)二級(jí)學(xué)科：藥理學(xué)論文作者：申瀟詠指導(dǎo)教師：尹海芳天津醫(yī)科大學(xué)研究生院二〇一五年五月分類號(hào)：R966學(xué)校代碼：10062密級(jí)：學(xué)號(hào)：2011601079學(xué)位類別：科學(xué)學(xué)位√專業(yè)學(xué)位?學(xué)科門類：醫(yī)學(xué)博士學(xué)位論

2、文DOCTORALDISSERTATION論文題目：肽核酸在杜興肌肉萎縮癥治療中的應(yīng)用研究TITLEInvestigationofPeptideNucleicAcidinDuchennemusculardystrophydiseasemodel一級(jí)學(xué)科：藥學(xué)二級(jí)學(xué)科：藥理學(xué)論文作者：申瀟詠指導(dǎo)教師：尹海芳導(dǎo)師組成員：天津醫(yī)科大學(xué)研究生院二〇一五年五月學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明:所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究工作取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注引用的內(nèi)容和致謝的地方外,論文中不一包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫

3、過的研究成果,與我同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均己在論文中作了明確的說明并表示了謝意。學(xué)位論文作者簽名:刂豇立.日期:γ侈鍆冫月冫日Ξ學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解天津醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定,即:學(xué)校有權(quán)將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,并采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編以供查閱和借閱。同意學(xué)校向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文,并編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫。保密匚彐,在年解密后適用本授權(quán)書。本論文屬于不保密函?！?請(qǐng)?jiān)谙鄬?duì)應(yīng)的方框內(nèi)打叫)學(xué)位論文作者簽名:日期彡F年/冫月怕導(dǎo)師簽名:日期'汐年

4、∫△月0El天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要杜興肌肉萎縮癥（DuchenneMuscularDystrophy-DMD）是一種X染色體連鎖遺傳的肌肉退行性遺傳病，由抗肌萎縮蛋白dystrophin基因發(fā)生突變引起dystrophin蛋白缺失所致，目前臨床尚無有效的治療方法。反義寡核苷酸（AntisensOligonucleotides,AOs）介導(dǎo)的外顯子跳讀在DMD的治療研究方面顯示出了巨大的潛力，已有兩種反義寡核苷酸藥物（2'OmeRNA和PMO）在III期臨床試驗(yàn)。然而，最近2'OmeRNA臨床試驗(yàn)未能達(dá)到預(yù)期的治療效果；同樣P

5、MO也低于預(yù)期結(jié)果。因此，新型反義寡核苷酸藥物的探索和研發(fā)對(duì)DMD疾病治療具有非常重要的意義。肽核酸（PeptideNucleicAcid，PNA）是一種新型、人工合成的化學(xué)結(jié)構(gòu)，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、與核酸的結(jié)合力強(qiáng)、特異性高等特點(diǎn)。在前期工作中，我們已在DMD小鼠（mdx）模型上，通過局部肌肉注射，初步展示了PNA介導(dǎo)外顯子跳讀的潛力。在本研究中，我們通過優(yōu)化不同長(zhǎng)度PNA的生物活性，獲得最佳候選長(zhǎng)度PNA20作為系統(tǒng)測(cè)試的藥物，并進(jìn)一步對(duì)PNA20給藥方案進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示：在高劑量重復(fù)給藥條件下，PNA20能夠高效地介導(dǎo)外顯子跳讀和d

6、ystrophin蛋白恢復(fù)表達(dá)，并能夠部分恢復(fù)mdx小鼠的的肌肉功能；同時(shí)在系統(tǒng)測(cè)試中，未檢測(cè)到任何藥物相關(guān)的毒副作用，充分展示了PNA作為一種新型反義寡核苷酸候選藥物，在DMD疾病外顯子跳讀療法中的應(yīng)用潛力。方法：1.不同長(zhǎng)度PNA在mdx小鼠上的局部測(cè)試。設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的PNA并在杜興肌肉萎縮癥動(dòng)物模型mdx小鼠上進(jìn)行局部測(cè)試。在前脛骨?。═ibialisanteriormuscle，TA）上分別注射PNA20(+2-18)、PNA25(+7-18)、PNA26(+10-16)、PNA28(+7-21)和PNA30(+14-16)，

7、兩周后收樣，通過免疫組化分析、RT-PCR和Westernblot方法檢測(cè)不同長(zhǎng)度PNA介導(dǎo)外顯子23跳讀效率及dystrophin蛋白恢復(fù)表達(dá)的水平。2.候選PNA在mdx小鼠上的系統(tǒng)測(cè)試。利用上步優(yōu)化所得的候選PNA，系統(tǒng)測(cè)試PNA25和PNA30介導(dǎo)dystrophin基因外顯子23跳讀效率及蛋白恢復(fù)的能力。按照25mg/kg的劑量，以尾靜脈注射的方法注射到mdx小鼠體內(nèi)，每周注射1次，連續(xù)注射3次，注射結(jié)束四周后收集各部位肌肉組織樣品，并通過免疫組化、RT-PCR等方法檢測(cè)其誘導(dǎo)外顯子23跳讀效率和dystrophin蛋白的表

8、達(dá)I天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文水平。3.酸性對(duì)PNA溶解性及活性影響的測(cè)試。用0.1M的NaOH調(diào)節(jié)PNA25的pH值分別為pH=2，3，4，5，6，7，用超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)其濃度。將pH=5-6以及pH=2-3的P