五種基因克隆技術(shù)

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1、生物技術(shù)通報(bào)·國(guó)內(nèi)信息·BIOTECHNOLOGYBULLETIN2002年第6期國(guó)內(nèi)信息五種基因克隆技術(shù)經(jīng)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)周?chē)?guó)嶺先生對(duì)國(guó)內(nèi)外64篇有關(guān)基因克隆技術(shù)的論文概括和分析,當(dāng)前基因克隆技術(shù)主要有5個(gè)類(lèi)別,即體位克隆或狀態(tài)克隆、轉(zhuǎn)位或轉(zhuǎn)DNA標(biāo)記法、同系位候選基因法、快捷順序標(biāo)記法、差接式快捷基因克隆法等。1體位克隆或狀態(tài)克隆首先將目的基因精確定位于分子標(biāo)記連鎖圖上,用連鎖標(biāo)記篩選大片段YAC,BAC,TAC,PAC或Cos2mid等文庫(kù),構(gòu)建含目的基因區(qū)的精細(xì)物理圖譜,采用染色體操作法逐步接近目的基因,如擬南芥的WIG2GUM基因克隆,人的NPC

2、1基因克隆。若側(cè)翼標(biāo)記與目的基因連鎖非常緊密,就可獲得包含目的基因的大片段克隆。將此作亞克隆分析或作探針篩選DNA文庫(kù),并將目的基因定位于一個(gè)較小的DNA片段上,再作序列分析與功能鑒定;若從DNA文庫(kù)中取BAC或PAC克隆末端序列分離體位克隆,利用BACP或PAC載體特有酶切位點(diǎn)NotI或sfiI和BAC片段中多酶切位點(diǎn)EcoRV,HpaI,StuI,XmnI進(jìn)行雙酶切再與質(zhì)粒體連接,并用PCR來(lái)分離,則對(duì)BAC長(zhǎng)鏈末端序列的分析和鑒定就更快速而高效。體位克隆或狀態(tài)克隆曾用于分離與擬南芥種子形成和發(fā)芽相關(guān)的脫落酸信號(hào)傳導(dǎo)基因ABI3、擬南芥ω-3脂肪酸

3、脫飽和酶基因FAD3、番茄抗霜霉病基因Pto、水稻抗白葉枯病基因XaZ1、小麥抗線蟲(chóng)基因Cre3以及200多個(gè)與人遺傳性疾病相關(guān)基因的克隆。這一類(lèi)別的克隆雖然作用很大,但由于需要構(gòu)建基因組文庫(kù),建立飽和分子標(biāo)記連鎖圖,要完善遺傳轉(zhuǎn)化體系,還要作大量測(cè)序工作,故此法投資較大,應(yīng)用也有一定的局限性。但隨著比較基因組學(xué)的發(fā)展,可利用同科異種間染色體共線性,通過(guò)比較基因組分析和染色體的穩(wěn)定性,可將物種性狀基因或分子標(biāo)記直接定位于該分子標(biāo)記連鎖圖中。如將小麥控制開(kāi)花基因(Vrn)和水稻控制谷粒硬度基因(Ha)定位于第5組染色體上;又如利用水稻圖譜信息篩選水稻和小

4、麥同線區(qū)的BAC或YAC測(cè)序和搜索候選基因。也還有較多的將QTL定位于分子標(biāo)記連鎖圖上,借鑒體位或狀態(tài)克隆法分離貢獻(xiàn)率大的QTL來(lái)改良某些不良性狀而適合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的要求。2轉(zhuǎn)位或轉(zhuǎn)DNA標(biāo)記法此法有五大基本程序,即首先進(jìn)行突變體的誘變和鑒定;第二用轉(zhuǎn)位或轉(zhuǎn)DNA作標(biāo)記DNA制成探針或引物篩選突變體基因組文庫(kù);第三用反義PCR技術(shù)分離出標(biāo)記DNA兩側(cè)的目的基因部分序列;第四依據(jù)序列設(shè)計(jì)探針或引物篩選野生型基因組文庫(kù),并分離出完整的基因;第五用基因互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)手段檢測(cè)此法的功能。利用此法可克隆到玉米抗圓斑病基因HML,利用其AC/DS系統(tǒng)克隆到番茄抗葉霉病基因C

5、f-9,利用其En/Spm系統(tǒng)克隆到擬南芥的1個(gè)雄性不育基因,利用其Mutator系統(tǒng)克隆到玉米T-胞質(zhì)中1個(gè)核恢復(fù)基因rf2,還可利用此法克隆到1個(gè)調(diào)節(jié)花器官發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子基因AG和擬南芥中1個(gè)抗線蟲(chóng)有關(guān)的基因。由于此法多用于異源植物,轉(zhuǎn)位頻率不高,拷貝數(shù)過(guò)多,易使誘變頻率很低,難以獲得轉(zhuǎn)位突變體,而親本所含轉(zhuǎn)位或通過(guò)轉(zhuǎn)基因或雜交進(jìn)行轉(zhuǎn)位才能引入,故此法有其局限性。特別對(duì)特定環(huán)境或特定發(fā)育階段有突變表型基因或和大基因組中以基因家族形式存在與有功能補(bǔ)償?shù)牟糠只蚣易?。在轉(zhuǎn)位過(guò)程中雖然發(fā)生插入突變,但不易看到突變表型。這也使轉(zhuǎn)位或轉(zhuǎn)DNA標(biāo)記法僅限于分離

6、克隆那些有明顯插入突變表2002年第6期生物技術(shù)通報(bào)BiotechnologyBulletin47型的基因。為此,此法發(fā)展成轉(zhuǎn)位收集或俘獲的無(wú)表型突變基因,包括增強(qiáng)子俘獲和基因俘獲兩種。當(dāng)前由于DNA測(cè)序技術(shù)飛快發(fā)展,大量基因序列信息和未知功能的基因被發(fā)現(xiàn),利用轉(zhuǎn)位DNA標(biāo)記法鑒定基因生物功能的技術(shù)更加廣泛。3同系位候選基因法為同源序列候選基因法,根據(jù)基因家族各成員間保守氨基酸序列設(shè)計(jì)引物,以此對(duì)含有目的基因DNA文庫(kù)用PCR擴(kuò)增,再擴(kuò)增、克隆和功能鑒定。對(duì)植物抗病基因所具有保守氨基酸序列(核苷酸結(jié)合位點(diǎn)NBS、富亮氨酸重復(fù)序列LRR、絲氨酸蘇氨酸蛋白

7、激酶STK、亮氨酸拉鏈LZ和橫跨膜結(jié)構(gòu)TM等),設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增植物DNA文庫(kù),并從所獲得的抗性克隆中找到一些新的抗性候選基因。諸如根據(jù)谷氨酸脫氫酶基因GDH結(jié)構(gòu)中某些序列存在物種中的保守性設(shè)計(jì)引物,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物制備探針篩選龍須草cDNA文庫(kù),可獲得GDH的整個(gè)cDNA;根據(jù)高度同源性基因,可直接制備探針作雜交篩選出另一物種DNA文庫(kù),再用豌豆淀粉合成酶SSⅡ的cDNA作探針篩選小麥的cDNA文庫(kù),可獲得小麥SSⅡa的cDNA;根據(jù)紅海鯛和紅鱒魚(yú)的生長(zhǎng)激素GH基因的cDNA篩選gsb的cDNA文庫(kù),獲得gsbGH的cDNA克隆;還根據(jù)gsbGH的

8、cDNA篩選gsb的基因組文庫(kù),克隆出gsbGH基因。對(duì)此法,國(guó)內(nèi)外生物技術(shù)學(xué)者雖然廣泛重視,