基因克隆技術(shù)

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1、第20卷第6期華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)Vol.20No.62001年12月JournalofHuazhongAgriculturalUniversityDec.2001,584~592基因克隆技術(shù)周國嶺楊光圣傅廷棟(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢430070)摘要綜述了基因克隆常用技術(shù)包括圖位克隆法、轉(zhuǎn)座子或T-DNA標(biāo)簽法、同源序列法、表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)法和差異表達(dá)基因分離方法的原理、應(yīng)用、應(yīng)用的潛力和限制因素。關(guān)鍵詞基因克隆;圖位克隆;轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽;T-DNA標(biāo)簽;同源序列;EST;差異表達(dá)基因中圖法分類號(hào)Q785人類基因組計(jì)劃(HGP)的迅速進(jìn)展及

2、幾種模質(zhì)的分離純化技術(shù),在大部分基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)功能式生物基因組測序的相繼完成為人類提供了大量的未知的情況下,人們不得不從另外的角度去尋求突基因組信息,這已成為人類探索生命奧秘的入手點(diǎn),破。近年來,反向遺傳學(xué)(reversegenetics)的建立,同時(shí)也為后基因組時(shí)代提供了更富有挑戰(zhàn)性的任為分離未知產(chǎn)物的基因提供了越來越多的策略和思務(wù)?；蚪M學(xué)時(shí)代的主要任務(wù)是圖譜制作和序列測路。定,后基因組學(xué)時(shí)代則是進(jìn)行基因組功能注釋1圖位克隆技術(shù)(map-basedcloning(genomeannotation),這也是功能基因組學(xué)的主要[1,2]orpositionalc

3、loning)研究目標(biāo)。但如何利用這些研究成果為人類服務(wù),基因則是一個(gè)重要的資源?？寺』虿粌H可隨著各種生物分子標(biāo)記連鎖圖的相繼建立和越以用來興旺生命科學(xué)工業(yè)(如制藥業(yè)等),改良農(nóng)作來越多的基因被定位,90年代初,圖位克隆技術(shù)也物、畜禽品種等,還可以對遺傳性疾病進(jìn)行基因治應(yīng)運(yùn)而生。其基本工作思路為:首先將目的基因精療,探索疾病的分子機(jī)制和生物發(fā)育調(diào)控規(guī)律。由確定位在分子標(biāo)記連鎖圖上,利用與目的基因緊密于基因組計(jì)劃要耗費(fèi)大量人力、物力、財(cái)力,所以并連鎖的標(biāo)記篩選大片段DNA文庫(如YAC、BAC、非每一種生物都可以拿來測序,而且模式生物的基TAC、PAC或cos

4、mid文庫),并構(gòu)建含目的基因區(qū)域因有時(shí)并不能直接用于其它生物,因而克隆其它生的精細(xì)物理圖譜,利用該物理圖譜采用染色體步行物中對人類有益的基因也變得日益重要。隨著基因(chromosomewalking)的方法逐步逼近目的基因(如[4]專利權(quán)的建立和完善,基因爭奪大戰(zhàn)的硝煙日益彌人的NPC1基因的克隆和擬南芥的WIGGUM[5]漫全球,克隆基因似乎有著一本萬利的誘惑力。在基因的克隆)。若側(cè)翼標(biāo)記與目的基因連鎖十分這樣一個(gè)大環(huán)境下,克隆基因的技術(shù)也隨著分子生緊密或共分離,無需步移就可直接著陸,獲得含目的物學(xué)發(fā)展的步伐而日臻完善和多樣化。在傳統(tǒng)遺傳基因的大片段克隆,

5、再將大片段克隆作亞克隆分析學(xué)(正向遺傳學(xué))占主導(dǎo)地位的時(shí)代,人們以基因產(chǎn)或用大片段克隆作探針篩選cDNA文庫,從而將目物為導(dǎo)向來分離克隆基因(功能克隆)。由于基因產(chǎn)的基因確定于1個(gè)較小的DNA片段上,進(jìn)一步作物的結(jié)構(gòu)、功能已知,可通過分析部分多肽或末端氨序列分析和目的基因功能鑒定?；蚪MDNABAC基酸序列,反推其核苷酸序列,設(shè)計(jì)探針或引物從基或PAC克隆末端序列的分離是圖位克隆中很重要因組DNA文庫或cDNA文庫中篩選克隆(如玉米的一步,Yang等利用BAC或PAC載體的特有酶切[3]組蛋白脫乙酰酶HD2基因的分離),也可以制備位點(diǎn)Not?或Sfi?和BAC片

6、段內(nèi)的多酶切位點(diǎn)產(chǎn)物抗體,從表達(dá)載體構(gòu)建的cDNA文庫中篩選相(EcoR、Hpa?、Stu?、Xmn?)進(jìn)行應(yīng)克隆,進(jìn)而分離目的基因。功能克隆受限于蛋白雙酶切,然后與質(zhì)粒載體連接,進(jìn)行錨定PCR來分收稿日期:2001-05-04周國嶺,女,1978年生,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)系在讀碩士生.武漢430070第6期周國嶺等:基因克隆技術(shù)585[6]離BAC的長末端序列,發(fā)展了一種高效快速的方僅局限應(yīng)用在人類、擬南芥、水稻、番茄等圖譜飽和法。圖位克隆法首先被應(yīng)用于模式植物擬南芥生物上。隨著比較基因組學(xué)的發(fā)展,人們意識(shí)到要(Arabidopsisthaliana),1992年

7、Giraudat等成功分充分利用圖譜飽和生物的遺傳信息服務(wù)于其它生離了與擬南芥種子形成和發(fā)芽相關(guān)的脫落酸信號(hào)傳物。我們可以利用同科異種間染色體共線性或同線[7]導(dǎo)基因ABI3,Arondel等則分離到擬南芥的X-3性,通過比較基因組分析和染色體著陸,將控制該物[8]脂肪酸脫飽和酶基因FAD3。由于抗性性狀的遺種有關(guān)性狀的基因或分子標(biāo)記直接定位在它的分子傳行為簡單,表型易鑒定,而人的遺傳性疾病也有這標(biāo)記連鎖圖中。如利用小麥與水稻基因組間的同線個(gè)特點(diǎn)且人類高密度的分子標(biāo)記連鎖圖已建立,所性,Sarma等將小麥控制開花時(shí)間的基因(Vrn)和以圖位克隆技術(shù)在分離植物抗性

8、基因和與人的遺傳控制谷粒