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《GBclonart基因克隆技術(shù)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、GBclonart基因克隆技術(shù)191
2、GenebankBiosciencesProprietary&Confidential
3、4/23/2012傳統(tǒng)的分子克隆方法TA克隆限制性酶切克隆平滑末端克隆缺點(diǎn)：連接效率低耗時(shí)較長需要特定限制性酶切位點(diǎn)202
4、GenebankBiosciencesProprietary&Confidential
5、4/23/2012April23,2012GBclonart克隆技術(shù)的優(yōu)點(diǎn):?任意載體?任意基因片段?不附加任何多余序列?不受限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的限制213
6、GenebankBiosciencesProprietary&Confidenti
7、al
8、4/23/2012April23,2012GBclonart基因克隆技術(shù)原理示意圖4250℃，30min單管反應(yīng)GBclonart是一種快速、簡單、高效的基因克隆技術(shù)！224
9、GenebankBiosciencesProprietary&Confidential
10、4/23/2012GBclonart基因克隆特點(diǎn)1.連接效率很高當(dāng)前產(chǎn)品質(zhì)量不符合要求，特別是buffer對(duì)連接的效率影響特別大，還有好多奸商購進(jìn)別的公司的產(chǎn)品然后回來稀釋賣出。2.背景低T4連接有時(shí)候背景很高，如果遇到特別的基因還很難連接進(jìn)去，而LIC連接要對(duì)載體進(jìn)行特殊的改造，這樣對(duì)一些特殊的構(gòu)建就有一定
11、的局限性，而GBclonart可以做到克服這樣的困難。3.特殊連接這種方法，對(duì)于一些特殊的鏈接特別有幫助，如你片段里有很多酶切位點(diǎn)，你在苦苦需找用什么酶切的時(shí)候，浪費(fèi)了你的好多腦細(xì)胞，而這種方法的好處是不用考慮你片段有什么酶切位點(diǎn)，只要考慮你在載體什么位點(diǎn)插入就可以了。4.多片段的鏈接5
12、GenebankBiosciencesProprietary&Confidential
13、4/23/2012克隆成功的關(guān)鍵?線性化載體制備?引物設(shè)計(jì)、PCR條件?克隆反應(yīng)設(shè)置?克隆感受態(tài)細(xì)胞的選擇?選用質(zhì)量好的膠回收或PCR純化試劑盒6
14、GenebankBiosciencesPropriet
15、ary&Confidential
16、4/23/2012載體線性化:雙酶切處理PCR擴(kuò)增采用酶切或PCR擴(kuò)增方法將載體線性化。質(zhì)粒的線性化不徹底將導(dǎo)致陰性克隆的產(chǎn)生，所以一般建議通過雙酶切。如使用PCR擴(kuò)增獲得線性化質(zhì)粒，所用的酶應(yīng)選用高保真酶（如Pfu酶）。7
17、GenebankBiosciencesProprietary&Confidential
18、4/23/2012April23,2012引物設(shè)計(jì)要點(diǎn)：1)引物的5’末端必須包含與載體末端相同的15個(gè)堿基序列2)引物的3’末端必須包含與目的基因片段相互補(bǔ)的特異堿基序列8
19、GenebankBiosciencesProprieta
20、ry&Confidential
21、4/23/2012克隆策略——對(duì)PCR片段的處理PCR產(chǎn)物有無雜帶？有無引物二聚體？均有或有雜帶無雜帶，有引物二聚體GelExtractionKitPCRPurificationKit均無基因克隆、轉(zhuǎn)化9
22、GenebankBiosciencesProprietary&Confidential
23、4/23/2012Gbclonart重組反應(yīng)目的基因片段線性化載體GBclonart重組反應(yīng)42℃30min反應(yīng)液直接轉(zhuǎn)化重組酶體系GBclonart反應(yīng)液15μl重組反應(yīng)：線性化載體xμlPCR片段xμl———總體積20μl10
24、GenebankBio
25、sciencesProprietary&Confidential
26、4/23/2012GBclonart無縫克隆結(jié)果：陽性I.線性化載體II.PCR片段III.反應(yīng)產(chǎn)物陰性對(duì)照GBclonart反應(yīng)液15μl線性化載體xμlPCR片段xμl———總體積20μl11
27、GenebankBiosciencesProprietary&Confidential
28、4/23/2012GBclonart無縫克隆注意事項(xiàng)：如何選擇PCR酶？使用任何PCR酶都可以，但推薦使用高保真Pfu酶。PCR產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)有限制嗎？沒有特別的限制。PCR產(chǎn)物末端有無A尾都能使用。載體末端的結(jié)構(gòu)有限制嗎？沒有特別
29、的限制。載體末端是平滑末端或是粘性末端都能使用。引物附加序列如果不是15個(gè)堿基可以嗎？引物附加序列為15～20個(gè)堿基都可以。GBclonart試劑盒的保存應(yīng)注意什么？-20℃或-80℃保存。12
30、GenebankBiosciencesProprietary&Confidential
31、4/23/2012
