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1、血清清蛋白的分離、純化和鑒定二、基本原理1、測量依據(jù)淀粉酶催化淀粉分子中α-1,4糖苷鍵水解,產(chǎn)生還原糖淀粉酶活力的大小與產(chǎn)生的還原糖的量成正比，可以單位體積樣品在一定時間內(nèi)生成的還原糖的量表示酶活力。2、相關(guān)反應(yīng):：淀粉酶產(chǎn)生的這些還原糖能使3，5－二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的3－氨基－5－硝基水楊酸。具體反應(yīng)式為：三、操作步驟實驗設(shè)備試管，滴管，容量瓶，分光光度計，酸度計，電熱恒溫水浴鍋，電磁爐。1.實驗設(shè)備：三、操作步驟（1）0.1mol/lpH5.6的檸檬酸緩沖液：A液：稱取檸檬酸20.01
2、g，定容至1000ml；B液：稱取檸檬酸鈉29.41g，定容至1000ml；取A液55ml與B液145ml混勻。（2）1%可溶性淀粉溶液：1g淀粉溶于100ml0.1mol/lpH5.6的檸檬酸緩沖液；實驗試劑及其配制：（3）1%3,5-二硝基水楊酸試劑：稱取3,5-二硝基水楊酸1g、NaOH1.6g、酒石酸鉀鈉30g，定容至100ml水中，緊蓋瓶塞，勿使CO2進(jìn)入；麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：取麥芽糖0.1g溶于100ml水中；（5）pH6.8的磷酸緩沖液:取磷酸二氫鉀6.8g,加水500ml使溶解，用0.1m
3、ol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，加水稀釋至1000ml即得。（6）0.4mol/L的NaOH溶液；（7）淀粉酶溶液三、操作步驟實驗步驟淀粉酶活力測定(1)取試管：取試管4支,2支為對照管,2支為測定管。(2)裝溶液：在2支對照管中分別加入4m10.4mol/L氫氧化鈉。(3)加試劑：在4支試管中各加入1mlpH5.6的檸檬酸緩沖液和淀粉酶溶液lml?；静僮?4)保溫：將4支試管置另一個37℃恒溫水浴中保溫15min,再向各管分別加入37℃下預(yù)熱的1％淀粉溶液2m1,搖勻,立即放入37℃恒溫水
4、浴保溫5min。取出后向測定管迅速加入4ml0.4mol/L氫氧化鈉,終止酶活動,準(zhǔn)備測糖。麥芽糖的測定：(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:取試管7支,編號.分別加入麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/ml）0,0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.0ml，然后用吸管向各管加蒸餾水使溶液達(dá)2.0ml,再各加3,5一二硝基水楊酸試劑2.0m1,置沸水浴中加熱10min，取出冷卻,用蒸餾水稀釋至25m1?；靹蚝笥梅止夤舛扔嬙?20nm波長下進(jìn)行比色,記錄吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，以麥芽糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線②（
5、操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)）樣品的測定:取酶作用后的各管溶液2m1,分別放入相應(yīng)的8支25ml具塞刻度試管中,各加入2m13,5-二硝基水楊酸試劑。置沸水浴中加熱10min.取出冷卻,用蒸餾水稀釋至25m1?；靹蚝笥梅止夤舛扔嬙?20nm波長下進(jìn)行比色,記錄吸光度，根據(jù)樣品比色吸光度平均值,從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出麥芽糖含量,最后進(jìn)行結(jié)果計算。計算公式：相關(guān)實驗一、實驗拓展方法二：碘-淀粉測定淀粉酶活性一、實驗?zāi)康恼莆諟y定淀粉酶活性的原理熟悉測定淀粉酶活性操作方法二、基本原理原理：淀粉酶催化淀粉分子中α-1,4糖苷鍵水解,
6、產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖及糊精。利用已知濃度的淀粉溶液作為底物，加入一定量的淀粉酶，在適應(yīng)條件下淀粉酶將部分淀粉水解。在底物過量的條件下，反應(yīng)后加入碘液與未被水解的淀粉結(jié)合成藍(lán)色復(fù)合物，其藍(lán)色的深淺與淀粉的濃度成正相關(guān),用分光光度計法測出反應(yīng)后淀粉的濃度，從而推算出單位體積樣品在一定時間內(nèi)消耗淀粉的量。五、討論依據(jù)血清電泳的結(jié)果作為陽性對照，判斷鹽析過濾液中有無清蛋白。②分析所獲得的清蛋白純度①分析有無分離獲得清蛋白根據(jù)層析液樣品電泳結(jié)果中雜蛋白條帶出現(xiàn)的情況，判斷分離的清蛋白純度。六、結(jié)論此課件下載可自行
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