《基因工程的載體》PPT課件

《《基因工程的載體》PPT課件》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。

1、第四章載體vector主要內(nèi)容載體的概念載體的分類質(zhì)粒載體λ噬菌體載體單鏈絲狀噬菌體載體一．載體的概念：1.要把一個有用的基因（目的基因——研究或應(yīng)用基因）通過基因工程手段送到生物細胞（受體細胞），需要運載工具（交通工具），將外源DNA或者基因攜帶進入宿主細胞的工具。2.凡來源于質(zhì)?；蚴删w的DNA分子，可以插入或克隆DNA片段統(tǒng)稱為vector。基因工程所用的vector實際上是DNA分子，是用來攜帶目的基因片段進入受體細胞的DNA。載體應(yīng)具備的條件（1）在宿主細胞內(nèi)能夠進行自我復制，具備復制原點。（2）有合適的限制性內(nèi)切酶位點，每種位點最好有且只有1個，供外源DNA的插入且不

2、影響其復制；（3）有選擇標記，例如抗藥性標記，藍白斑試驗，便于篩選；（4）有一定容量且有較高的拷貝數(shù)，易于制備。多克隆位點ori復制起始點遺傳標記Amppolylinker載　　體二、載體的分類分類依據(jù)類別克隆擴增或表達舉例按功能（1）克隆載體（2）表達載體√√PBR322PCDN3按進入受體細胞類型（1）原核載體（2）真核載體（3）穿梭載體PUC8PBUDCE41YE√克隆載體（cloningvector）都有一個松弛的復制子，能帶動外源基因，在宿主細胞中復制擴增。它是用來克隆和擴增DNA片段（基因）的載體。表達載體（Expressionvector）具有克隆載體的基本元件（o

3、ri,Ampr,Mcs等）還具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA順序的載體。為了有效的轉(zhuǎn)錄，必需有強大的能夠被宿主細胞識別的啟動子，為了實現(xiàn)翻譯，克隆基因必需有合適的SD和RbS。具有表達和調(diào)控能力的載體稱表達載體。三、質(zhì)粒載體1、質(zhì)粒是細菌染色體外能自主復制的環(huán)形雙鏈DNA分子。2、編碼抗菌素抗性基因的質(zhì)粒叫R質(zhì)粒。（一）質(zhì)粒的生物學特性3、質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外地游離狀態(tài)，但在一定地條件下又會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體地復制而復制。4、質(zhì)粒DNA在添加真核復制信號和啟動子后，可以構(gòu)建出能在原核和真核細胞中均可復制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細胞中表達，因此這類載體

4、在基因工程中應(yīng)用廣泛。5、根據(jù)每個寄主細胞中質(zhì)?？截悢?shù)的多少，把質(zhì)粒分為嚴緊型復制質(zhì)粒（拷貝數(shù)少，為1-5個）與松弛型復制質(zhì)粒（拷貝數(shù)多，可達10-200個拷貝）。因此，作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的。6、質(zhì)粒的不親和性：兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。質(zhì)粒復制子拷貝數(shù)pBR322及其衍生質(zhì)粒pMB115～20pUC系列質(zhì)粒及其衍生質(zhì)粒突變的pMB1500～700pACYC及其衍生質(zhì)粒p15A10～212pSC101及其衍生質(zhì)粒pSC101～5ColE1ColE115～20（二）標記基因按其用途可將標記基因分為選擇標記基因和篩選標記基因。選擇

5、標記基因用于鑒別目標DNA（載體）的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來。篩選標記基因可用于將特殊表型的重組子挑選出來。篩選標記主要用來區(qū)別重組質(zhì)粒與非重組質(zhì)粒，當一個外源DNA片段插入到一個質(zhì)粒載體上時，可通過該標記來篩選插入了外源片段的質(zhì)粒，即重組質(zhì)粒。１選擇標記基因(1)氨芐青霉素抗性基因（Ampicillinresistancegene）(2)四環(huán)素抗性基因（Tetracyclineresistancegene）(3)氯霉素抗性基因（chloramphenicolresistancegene）(4)卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycinresist

6、ancegene）(5)琥珀突變抑制基因supF(6）其它還有一些正向選擇標記，表達一種使某些宿主菌致死的基因產(chǎn)物，而含有外源基因片段插入后，該基因便失活rr2篩選標記基因(1)α-互補（α-complementation）又稱藍白斑試驗（IPTG-X－gal試驗）α-互補是指lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，由1024個氨基酸組成）陰性的突變體之間實現(xiàn)互補。誘導物ZYXPOZYXPO乳糖X-galLacZ藍色化合物X-gal標志補救（?-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H?片段COOH?片段lacZ

7、(２)插入失活對于雙抗性標記的質(zhì)粒，當外源ＤＮＡ片段插入任何一個抗性基因中都會造成該抗性的喪失，從而篩選出重組子．pBR322質(zhì)粒載體TetrAmprOripBR322質(zhì)粒載體抗藥性標志的選擇pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板（三）質(zhì)粒載體的種類發(fā)展階段：第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322。第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標記基因。如pUC系列載體。