《基因工程載體B》PPT課件

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1、第2節(jié)病毒(噬菌體)克隆載體本節(jié)主要內(nèi)容λ噬菌體病毒載體Cosmid載體M13單鏈?zhǔn)删w病毒載體噬菌粒載體植物病毒載體CaMV(花椰菜花葉病病毒)克隆載體TMV(煙草花葉病毒)克隆載體動物病毒載體SV40克隆載體反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體（勞斯肉瘤病毒）腺病毒克隆載體痘苗病毒克隆載體桿狀病毒表達(dá)克隆載體噬菌體：感染細(xì)菌的病毒病毒：一類超顯微的非細(xì)胞生物,每一種病毒只含有一種核酸（DNA和RNA不會并存于同一病毒顆粒中）特點：只能在活細(xì)胞內(nèi)營專性寄生;離體條件下,以無生命的化學(xué)大分子狀態(tài)存在對抗生素不敏感，對干擾素敏感病毒與宿主關(guān)系來分：

2、溫和性病毒構(gòu)建載體的好材料烈性病毒通過改造，也可用于構(gòu)建載體病毒克隆載體應(yīng)用的局限性：溫和性病毒和烈性病毒都存在嚴(yán)格的宿主專一性部分病毒的性質(zhì)一.噬菌體T2噬菌體結(jié)構(gòu)示意圖三類典型形態(tài)的病毒：▼廿面體對稱的結(jié)構(gòu)(球狀)▼螺旋對稱的結(jié)構(gòu)(桿狀)▼復(fù)合對稱的結(jié)構(gòu)(蝌蚪狀)大腸桿菌的T4噬菌體:由橢圓形的二十面體頭部和螺旋對稱的尾部組合而成病毒中復(fù)合對稱的代表噬菌體的生命周期分為:溶菌周期和溶源周期烈性噬菌體:只具有溶菌生長周期的噬菌體溫和噬菌體:既能進(jìn)入溶源生命周期又能進(jìn)入溶菌周期的噬菌體溶源周期:感染過程中無子代噬菌體顆粒,噬菌體

3、DNA整合到寄主細(xì)胞染色體DNA,細(xì)菌繼續(xù)生長增殖,噬菌體的基因作為細(xì)菌染色體的一部分進(jìn)行復(fù)制烈性噬菌體的繁殖途徑Phagereproductivecycle吸附Phageattachestobacterialcell.注入核酸PhageinjectsDNA.合成核酸和蛋白質(zhì)PhageDNAdirectshostcelltomakemorephageDNAandproteinparts.裝配Newphagesassemble.釋放Celllysesandreleasesnewphages.透明的不長菌的小圓斑典型的烈性噬菌體的生

4、命周期20-60min溫和噬菌體的繁殖途徑溶原化途徑溶菌途徑λ溶源性細(xì)菌特點：超感染免疫性（抗御同種噬菌體再次感染的特性）溶源性細(xì)菌可誘發(fā)進(jìn)入溶菌周期(OL、OR擺脫cI阻遏蛋白后進(jìn)入該周期)?cI=阻遏基因O=操縱基因P=啟動子L=左向R=右向c、λ噬菌體在宿主體外與蛋白質(zhì)結(jié)合包裝成為含雙鏈線狀DNA的顆粒，分為四個區(qū)。λ噬菌體與λ噬菌體載體的特點：a、λ噬菌體是使用最早、研究最為詳盡的大腸桿菌雙鏈DNA噬菌體；1974年作為克隆載體使用。中等大小的溫和噬菌體；常用于構(gòu)建基因組文庫和cDNA文庫；b、λ噬菌體載體克隆效率遠(yuǎn)高于

5、質(zhì)粒載體，獲得的文庫大而完整，構(gòu)建的文庫容易篩選、擴(kuò)增和保存。線狀λ噬菌體基因組的四個區(qū)：左側(cè)區(qū)、中間區(qū)、右側(cè)區(qū)（調(diào)控成分、復(fù)制基因O和P、溶菌基因S和R）和末端結(jié)構(gòu)（λ噬菌體的DNA在噬菌體中是線狀DNA分子，基因組是一長約48502bp的雙鏈DNA）λ噬菌體cos位點由位于λ噬菌體線形雙鏈DNA的兩端且完全互補(bǔ)的粘末端（12bp）結(jié)合成的雙鏈稱為Cos位點att位點attLattR噬菌體插入大腸桿菌基因組方式Champbell模型λ噬菌體DNA環(huán)化的λ噬菌體DNAIntegrase催化鏈的交換包裝限制：離體條件下，將重組體D

6、NA包入噬菌體等病毒顆粒中以形成有功能的病毒載體；λ噬菌體頭部外殼蛋白質(zhì)容納DNA的能力:上限：野生型DNA總量（48kb）的5％左右低限：野生型DNA總量（48kb）的75％構(gòu)建λ噬菌體的基本策略與技術(shù)路線：(1)去除λ噬菌體非必須區(qū)方法：去除非必須片斷(復(fù)制、裂解等非必須)同時，抹去一些酶切位點λ噬菌體的包裝限制:大小51-36kb之間溶菌途徑：λ噬菌體感染Ecoli后，線形λDNA注入細(xì)胞內(nèi)，若進(jìn)入溶菌生長途徑，則粘性末端連接成環(huán)狀DNA分子，指令宿主細(xì)胞合成與包裝相關(guān)的系列殼蛋白和酶，復(fù)制出新的λDNA，包裝成子代噬菌體

7、顆粒，并在R蛋白和S蛋白的作用下，宿主細(xì)胞破裂，釋放出大量子代噬菌體顆粒，感染新的細(xì)胞。依靠cos位點形成環(huán)狀的λ噬菌體DNA代表性λ噬菌體載體插入型載體(insertionvectors)：只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點（只能承受10kb以內(nèi)的小片段外源DNA的插入，廣泛用于cDNA及小片段DNA的克?。┲脫Q型載體(replacementvectors)：具有成對的克隆位點，在這兩個位點之間的DNA區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代（可承受較大分子量的外源DNA片段的插入，適用于克隆高等真核生物的染色體DNA）置換型

8、插入型插入失活效應(yīng)：外源的DNA克隆進(jìn)入插入型的λ載體分子上，會使噬菌體的某種生物功能喪失效力。免疫功能失活的（inactivatiortofimmunityfunction）和大腸桿菌β-半乳糖苷酶失活的（inactlvatlonofE．coliβ-galac