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1、位克隆技術(shù)的原理及其在分離玉米基因中的應(yīng)用劉朝顯2010.11.32內(nèi)容摘要圖位克隆技術(shù)的基本原理1圖位克隆的技術(shù)環(huán)節(jié)2圖位克隆在分離玉米基因中的應(yīng)用3一.圖位克隆技術(shù)的基本原理1.圖位克隆（Map-basedcloning）:定位克?。╬ositioncloning）,1986年首先由劍橋大學(xué)的Alancoulson提出。正常遺傳學(xué)2.基本原理：根據(jù)功能基因在基因組中都有相對較穩(wěn)定的基因座，在利用分子標(biāo)記技術(shù)對目的基因精細(xì)定位的基礎(chǔ)上，用與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選DNA文庫，通過染色體步移(chromosomewalking)逼近目的基因或通過染色體登陸(chromosomeland
2、ing)方法最后找到包含有該目的基因的克隆，最后經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)證實(shí)目的基因功能。33.圖位克隆技術(shù)的優(yōu)越性與局限性優(yōu)點(diǎn)：不需要事先了解目的基因的表達(dá)產(chǎn)物，這為克隆許多有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的農(nóng)作物基因提供了有效的手段，因?yàn)檫@些基因的產(chǎn)物大多都是未知的。缺點(diǎn)：基因組中的重復(fù)序列導(dǎo)致染色體步移困難，甚至將步移引入歧途。4一.圖位克隆技術(shù)的基本原理4.圖位克隆示意圖5一.圖位克隆技術(shù)的基本原理M1M2Gene連鎖標(biāo)記的篩選M1M2Gene初定位M3M2Gene精細(xì)定位M3M4M5M6M7M8合成探針篩選基因組文庫轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證BSA，NIL300左右5000左右二.圖位克隆的技術(shù)環(huán)節(jié)61.定位群體的構(gòu)建⑴
3、親本選擇原則:選擇高度純合，遺傳差異大，DNA多態(tài)性豐富的親本（實(shí)現(xiàn)基因精細(xì)定位的重要前提）可選用多個(gè)親本進(jìn)行多態(tài)性篩選⑵定位群體的組配：基因的定位是基于分離后代中交換單株出現(xiàn)的頻率大小而實(shí)現(xiàn)的，因此組配一個(gè)遺傳信息多群體大小適中的分離群體尤其重要。BC1,F2非永久性群體群體類型RIL,DH，NIL永久性群體2.初定位(玉米：100-350株)近等基因系（near-isogenicline,NIL）法:近等基因系是指幾乎僅在目標(biāo)性狀上存在差異的兩種基因型個(gè)體,這可通過連續(xù)回交的途徑獲得。由于NILs的遺傳組成特點(diǎn),一般凡是能在近等基因系間揭示多態(tài)性的分子標(biāo)記就極有可能位于目標(biāo)基因的兩翼附近
4、。7二.圖位克隆的技術(shù)環(huán)節(jié)Chromosomelanding:aparadigmformap-basedgenecloninginplantswithlargegenomes.Tanksleyetal.19958二.圖位克隆的技術(shù)環(huán)節(jié)集團(tuán)分離分析法（bulkedsegregantanalysis,BSA）:將分離群體中研究的目標(biāo)性狀根據(jù)其類型(如抗病、感病)分成2組，將每組內(nèi)一定數(shù)量的植株DNA等量混合，形成2個(gè)池，這2個(gè)池僅在目標(biāo)性狀(如抗病性)上有差異。利用分子標(biāo)記技術(shù)尋找2個(gè)池的擴(kuò)增譜帶的差異，這種多態(tài)性極可能與目標(biāo)基因連鎖。9Chromosomelanding:aparadigmfo
5、rmap-basedgenecloninginplantswithlargegenomes.Tanksleyetal.199510M1M2二.圖位克隆的技術(shù)環(huán)節(jié)P1P2F1P2BC1初定位示意圖Recombinant1Recombinant2MarkerIMarkerIITargetgene3.精細(xì)定位（玉米4000株）11二.圖位克隆的技術(shù)環(huán)節(jié)MarkerIMarkerIIIMarkerVMarkerVIMarkerIVMarkerIITargetgene上游交換單株下游交換單株4.構(gòu)建高質(zhì)量、容易操作的大片段基因組文庫在基因的圖位克隆技術(shù)中，高質(zhì)量的基因組文庫的構(gòu)建也是克隆成功的關(guān)鍵。Y
6、AC:插入片段大（100-2000Kb）,加速染色體步移;嵌合情況嚴(yán)重，遺傳不穩(wěn)定，插入片段內(nèi)部重排或者缺失，插入片段分離難，轉(zhuǎn)化效率低。BAC：片段插入一般在150Kb左右。嵌合現(xiàn)象少，以大腸桿菌為寄主，轉(zhuǎn)化效率高，提取容易，用途廣泛?？滤官|(zhì)粒文庫：兼具了質(zhì)粒和λ噬菌體兩方面的特性插入片段最大可達(dá)45kb。12二.圖位克隆的技術(shù)環(huán)節(jié)5.鑒定目標(biāo)基因利用與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記篩選基因組文庫（PCR反應(yīng)或者菌落雜交），鑒定陽性克隆，并進(jìn)行亞克隆測序，預(yù)測基因，確定候選基因。候選基因的確定：（1）比較候選基因序列在野生型與突變型之間的差異，確定在二者之間變異的cDNA序列;（2）證實(shí)候選基因的
7、時(shí)空表達(dá)模式與目標(biāo)性狀的表現(xiàn)相同;（3）轉(zhuǎn)化候選基因，進(jìn)行遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，這是最直接、最終鑒定基因的方法。13二.圖位克隆的技術(shù)環(huán)節(jié)三.圖位克隆在分離玉米基因中的應(yīng)用1992年應(yīng)用圖位克隆技術(shù)首先在擬南芥中成功分離基因ABI3和FAD基因。隨后利用圖位克隆技術(shù)又成功的從擬南芥、水稻、大麥、玉米和番茄等植物中克隆到了多個(gè)基因。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，擬南芥、黃瓜、水稻、玉米、高粱、大豆等植物的基因組測序已經(jīng)完成，海量
