擬南芥基因的圖位克隆技術(shù)

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1、擬南芥基因的圖位克隆技術(shù)擬南芥（Arabidopsisthaliana）是一種模式植物，具有基因組?。?25Mbp）、生長(zhǎng)周期短等特點(diǎn)，而且基因組測(cè)序已經(jīng)完成（TheArabidopsisGenomicInitiative,2000）。從遺傳學(xué)的觀點(diǎn)來(lái)看，基因克隆的途徑可概括為正向遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)兩種。正向遺傳學(xué)途徑指的是通過(guò)被克隆基因的產(chǎn)物或表現(xiàn)型突變?nèi)ミM(jìn)行反向遺傳學(xué)途徑則指的是依據(jù)被克隆基因在染色體上的位置來(lái)實(shí)現(xiàn)圖位克隆（map-basedcloning）又稱定位克?。╬ositionalcloning），1986年

2、首先由劍橋大學(xué)的AlanCoulson提出，用該方法分離基因是根據(jù)目的基因在染色體上的位置進(jìn)行的，無(wú)需預(yù)先知道基因的DNA序列，也無(wú)需預(yù)先知道其表達(dá)產(chǎn)物的有關(guān)信息。它是通過(guò)分析突變位點(diǎn)與已知分子標(biāo)記的連鎖關(guān)系來(lái)確定突變表型的遺傳基礎(chǔ)。圖位克隆能實(shí)現(xiàn)，關(guān)鍵在于全基因組(Col-0生態(tài)型)測(cè)序計(jì)劃的完成和各種分子標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)。這些數(shù)據(jù)被儲(chǔ)存在專門(mén)的數(shù)據(jù)庫(kù)中（表1）。分子標(biāo)記:實(shí)現(xiàn)基因圖位克隆的關(guān)鍵是篩選與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記。分子標(biāo)記是一個(gè)特異的DNA片段或能夠檢出的等位基因，對(duì)其有效地利用即可達(dá)到圖位克隆基因之目的。迄今為止

3、，已有幾十種技術(shù)可用于分子標(biāo)記的篩選,其中最為常用的是簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性（SSLP）,和單核苷酸多態(tài)性（SNP）。SSLP：簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)是基于PCR的分子標(biāo)記，在擬南芥基因組中有較多分布（在Col和Ler兩個(gè)生態(tài)型中，每1000bp有4—11個(gè)不同的序列），而且是共顯性的，它的檢測(cè)非常直接，需要設(shè)計(jì)引物來(lái)檢測(cè)假定的SSLP標(biāo)記SNP：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性，它是擬南芥不同生態(tài)型之間基因組中的單個(gè)核苷酸的差別，這些差別的核苷酸通常位于不編碼區(qū)域。最常見(jiàn)的用于檢測(cè)SNP標(biāo)記的方法主要是剪切（酶解）擴(kuò)增多態(tài)性序列（CAPS），它也是

4、基于PCR的。因?yàn)橛辛藬M南芥的基因組序列和高密度的遺傳標(biāo)記，圖位克隆過(guò)程就變得相對(duì)直接。從基于Col-0和Ler遺傳背景的突變體出發(fā)，我們有可能在大約一年時(shí)間內(nèi)找出與這個(gè)突變相關(guān)的基因，作為作圖過(guò)程的第一步，突變體植株將和另外一個(gè)生態(tài)型（Col-0或者Ler）的植株雜交。然后播種F1代種子。在F1代植物的生長(zhǎng)過(guò)程中，我們就有可能來(lái)對(duì)其表現(xiàn)型和基因型進(jìn)行分析。F1代植物的表型的出現(xiàn)或者消失將顯示著我們所研究的突變是顯性的還是隱性的。col0誘變繁種淘汰致死突變和不能繁殖突變篩選突變體處理Landsberg野生型×確定突變體是

5、否是單基因突變及顯隱性突變體篩選基因圖位克隆aaAA×Col-0突變體Landsberg野生型F1aA×1234512345aAaAAAaaF2粗定位在大多數(shù)情況下，用于雜交的突變體植株是作為父本還是母本是沒(méi)有關(guān)系的。aaaaaaaamakerCol-0Ler單交換雙交換不交換不交換重組率＝單交換＋2×雙交換2×樣品總數(shù)×100％Col-0LerCol-0Ler在15個(gè)maker中，重組率最小者距目標(biāo)基因最近細(xì)定位a粗定位maker細(xì)定位maker細(xì)定位maker在3個(gè)maker中，重組率最小者目標(biāo)基因距該maker最近循

6、環(huán)若干次一般情況下能在突變兩側(cè)找到相距小于40Kb的兩個(gè)分子標(biāo)記。找到之后，就可以通過(guò)測(cè)序來(lái)找到突變基因。一種有效的方法是設(shè)計(jì)PCR引物來(lái)擴(kuò)增覆蓋這40Kb的多個(gè)重疊的500bp的片段。將這些片段測(cè)序后拼接起來(lái)以得到整個(gè)40Kb的序列，然后將它與野生型植物（Col-0或者Ler）的序列進(jìn)行比對(duì)，這就可以找到這個(gè)區(qū)域中的多個(gè)基因。從一系列侯選基因中鑒定基因是定位克隆技術(shù)的最后一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。現(xiàn)在最常用的方法是用含有目標(biāo)基因的大片段克隆如BAC克隆或YAC克隆去篩選cDNA文庫(kù)，并查詢生物數(shù)據(jù)信息庫(kù)，待找出侯選基因后，把這些侯選

7、基因進(jìn)行下列分析以確定目標(biāo)基因：（1）精確定位法檢查cDNA是否與目標(biāo)基因共分離；（2）檢查cDNA時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)是否與表型一致；（3）測(cè)定cDNA序列，查詢數(shù)據(jù)庫(kù)，以了解該基因的功能；（4）篩選突變體文庫(kù)，找出DNA序列上的變化及與功能的關(guān)系；（5）進(jìn)行功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)轉(zhuǎn)化突變體觀察突變體表型是否恢復(fù)正?；虬l(fā)生預(yù)期的表型變化。存在的問(wèn)題:圖位克隆也有其自身的局限性，在某些情況下，就很難或者不能通過(guò)圖位克隆技術(shù)來(lái)定位基因1.一個(gè)給定的性狀是由不止一個(gè)的基因位點(diǎn)控制的2.表觀（上位）遺傳突變:一個(gè)基因在表達(dá)和功能上的可遺傳改

8、變，而不涉及DNA序列的改變，這是圖位克隆工程中又一個(gè)可能的復(fù)雜情況3.染色體上位點(diǎn)的物理和遺傳距離的比值變化是比較小的，對(duì)作圖的分辨率也只有較小的影響,1%重組的遺傳距離相當(dāng)于100--400Kb的物理距離，平均是250Kb。然而著絲粒區(qū)域是一個(gè)顯著的例外，在這里1%重組的遺傳距離相當(dāng)于1000--2