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1、圖位克隆的基本原理和方法何宗順2011.12.7圖位克隆的基本原理其基本的原理是：功能基因在基因組中都有相對(duì)較穩(wěn)定的基因座，通過(guò)找到與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，在利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)目的基因精細(xì)定位的基礎(chǔ)上，由于水稻全基因組序列的發(fā)布，我們可以得到已定位區(qū)段的候選基因，通過(guò)對(duì)候選基因進(jìn)行分析，確定目標(biāo)基因，最后經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)證實(shí)目的基因功能。圖位克隆的步驟：PrimarymappingFinemappingCandidategeneComplementationtestFunctionalanalysisPrimarymapp
2、ingTraitmethodMappingpopulationQualitativetraitsbulkedsegregmentanalysisF2、BC1Quantitativetraitswhole-genomeQTLscreenRIL、DH、NILprimarymappingmethodandMappingpopulation作圖群體將純合突變體與ZS97進(jìn)行雜交，對(duì)雜交的種子進(jìn)行基因型鑒定，找到雜合型種子（即種子能夠發(fā)生分離），將雜合F1代種子種下去后就能得到F2代群體。R/Rr/rR/RR/rF2×R/rr/rF1P
3、1純合突變體P2ZS97primarymappingmethodBulkedSegregmentAnalysis：群組分離分析法。原理是將分離群體(F2、BC1等)中的個(gè)體依據(jù)研究的目標(biāo)性狀(如抗病、感病)分成兩組，每一組取樣8-15份，在每一組群體中將各個(gè)體DNA等量（等濃度等體積）混合，形成兩個(gè)DNA池(如抗病池和感病池)。同時(shí)需要構(gòu)建兩個(gè)親本（ZH11/ZS97）的BSA池。由于分組時(shí)僅對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇，因此兩個(gè)池間理論上就應(yīng)主要在目標(biāo)基因區(qū)段存在差異。ZH11ZS97HL15(W)HL15(M)HY1(W)HY1(M
4、)HY2(W)HY2(M)HY3(W)HY3(M)HY5(W)HY5(M)ZH11ZS97HL15(W)HL15(M)ZH11ZS97HL15(W)HL15(M)將構(gòu)建的BSA池分別用本室的255對(duì)在親本ZH11/ZS97間存在多態(tài)性的SSR標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)跑PAGE膠找到與目標(biāo)性狀緊密連鎖的標(biāo)記。找到緊密連鎖的分子標(biāo)記之后我們就要進(jìn)行一個(gè)“陽(yáng)性”檢測(cè)：即檢測(cè)這個(gè)找到的分子標(biāo)記是不是真正的與目標(biāo)性狀連鎖。我們對(duì)F2代群體中隨機(jī)選取一個(gè)200左右的小群體，將找到的分子標(biāo)記分別擴(kuò)增這些樣，看表型與基因型是否對(duì)應(yīng)。同時(shí)我們可
5、以用這個(gè)小群體進(jìn)行一個(gè)初步的基因定位。Finemapping一.表型觀察二.篩選交換單株三.開(kāi)發(fā)新的分子標(biāo)記R/Rr/rR/RR/rF2×R/rr/rF1P1純合突變體P2ZS97正常表型突變表型ZH11：“A”ZS97：“B”交換有兩種帶型：H和B單株12345678910M1M2M3M4M5HAABHAAAABHAABAAAAAAAAAAAAAAAAAHAAABHHAAAHHAABBHBA基因和表型相對(duì)應(yīng)！開(kāi)發(fā)新的標(biāo)記：新的SSR標(biāo)記：http://redb.ncpgr.cn/modules/redbtools/ssrsc
6、an.php，運(yùn)行SSRScan就會(huì)得到該段序列的簡(jiǎn)單重復(fù)序列。InDel/Caps標(biāo)記：將要開(kāi)發(fā)標(biāo)記的日本晴區(qū)段序列與93-11做一個(gè)blast，選取插入或者缺失比較大的位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物。SNPS標(biāo)記:可以通過(guò)測(cè)序找到在ZH11/ZS97間存在單堿基差異的位點(diǎn)，或者找謝老師咨詢。Candidategene將最后精細(xì)定位區(qū)段在http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/中輸入定位區(qū)間的物理位置，即可顯示出候選基因。精細(xì)定位擴(kuò)大群體，進(jìn)行精細(xì)定位找到候選基因后可對(duì)候選基
7、因進(jìn)行分析以排除非目標(biāo)基因，可以通過(guò)比較擴(kuò)增，測(cè)序，表達(dá)量檢測(cè)及目標(biāo)性狀相關(guān)的生化和生理途徑等方法來(lái)排除。當(dāng)然最后要說(shuō)明問(wèn)題的話就是構(gòu)建互補(bǔ)載體做一個(gè)互補(bǔ)驗(yàn)證。Complementationtest
