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1、圖位克隆原理簡要說明1在擬南芥的眾多生態(tài)型中最常用的三種是Landsbergerecta(Ler)Columbia(Col)Wassilewskija(Ws)其中Col生態(tài)型用于擬南芥的全基因組測序。2MarkerSSLPsCAPsdCAPsInDelSNP多態(tài)性3SSLP=simplesequencelengthpolymorphisms簡單序列長度多態(tài)性又稱SSR=simplesequencerepeats比較產(chǎn)物長度4CAPs=cleavedamplifiedpolymorphicsequences酶切擴增多態(tài)性利用酶切位點5Marker:MIG5
2、-BCLHC6dCAPs=derivedCAPS設計引物引入錯配堿基，從而引入酶切位點7其它標記InDel=insertion-deletion插入缺失標記，指的是兩種親本中在全基因組中的差異，相對另一個親本而言，其中一個親本的基因組中有一定數(shù)量的核苷酸插入或缺失。根據(jù)基因組中插入缺失位點，設計一些擴增這些插入缺失位點的PCR引物，這就是InDel標記。部分SSLP就是由InDel轉(zhuǎn)化而來密度：每6.6kb存在一個8SNP=singlenucleotidepolymorphism單核苷酸多態(tài)性主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)
3、性。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉(zhuǎn)換或顛換所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。但通常所說的SNP并不包括后兩種情況。(后面兩種情況的多態(tài)性一般歸為InDel）密度：每3.3kb存在一個9SSLPs10粗定位引物（更新）11粗定位引物（混合）121314F1父本染色體母本染色體15F1假設：Aa突變位點BbMarker突變?yōu)殡[性突變16F1配子長根長根長根長根長根短根短根長根長根短根17F2短根個體Col單帶Ler單帶ColLer雙帶因為F2代根據(jù)表型來篩選個體時，我們?nèi)斯みx擇的是短根表型，選擇的個體為短根aa，即突變
4、位點不可能存在交換，交換率=0其他位點可能存在交換，利用帶型差異判斷交換次數(shù)18wildtypemutant雜交ColLerF1plant圖中的兩個親本不但在A/a位點有差異，在其他位點也存在大量的遺傳差異，可以利用這些差異設計分子標記，對染色體的具體區(qū)段進行標定。在該例子中，該染色體上總共確定了5個分子標記，標定了5個不同區(qū)段。假設：Aa突變位點有5個Marker19只有左側(cè)三種植株會選入定位群體自交F2plants假設：只存在單交換20分子標記M5與突變位點的遺傳距離：10/1006/1004/100(20/(100×2))×100%=10cMM5處
5、發(fā)生交換的植株包括三種情況假設：統(tǒng)計100個個體21分子標記M4與突變位點的遺傳距離：6/1004/100(10/(100×2))×100%=5cM22分子標記M3與突變位點的遺傳距離：4/100(4/(100×2))×100%=2cM23M4m4如何分辨來自于兩個親本的染色體？目前最常用的分子標記是利用兩個親本中同一染色體區(qū)段的長度差異來設計的，如左圖親本Ler的M4處染色體區(qū)段長于親本Col中m4染色體區(qū)段，在該差異位點兩側(cè)設計引物經(jīng)PCR擴增后得到的PCR產(chǎn)物就會有不同長度，電泳后M4泳動速度慢，m4泳動速度快，因此通過電泳就可以分辨來自于兩個親本
6、的染色體區(qū)段24包含來自于兩個親本的染色體片段包含來自于Col兩條染色體區(qū)段包含來自于Ler兩條染色體區(qū)段注意后兩種情況反映的是來自于兩個配子的染色體區(qū)段的情況25Col*********1、4、8、10、11、13、15、18、19共9個樣品，只包含來自于親本Col的染色體區(qū)段，沒有發(fā)生交換26Ler***5、6、14共3個樣品，只包含來自于親本Ler的染色體區(qū)段，也就是發(fā)生了兩次交換27Col*******2、3、7、9、12、16、17共7個樣品，包含1個來自于親本Col的染色體區(qū)段以及1條來自于親本Ler的染色體區(qū)段，即發(fā)生了一次交換Ler28突
7、變位點與分子標記M的遺傳距離：交換次數(shù)配子總數(shù)×100%3×2+719×2×100%≈34cM=293031SSLPs32SSLPs3340.48%20.00%4.76%4.76%12.5%12.5%36%34步驟總結(jié)篩選F2代短根移栽提基因組各對引物PCR統(tǒng)計計算Rf縮小范圍尋找新Marker擴大群體(篩選重組子)3周左右35在突變位點附近區(qū)域內(nèi)絕大部分的樣品跑樣結(jié)果都應該為只有非重組的Col條帶，即記錄Rf為0，只有少數(shù)的樣品存在交換，Rf記為1。圖中的6、12號樣品即為重組子什么是重組子36在篩選出6、12號兩個重組子以后，假設在目標區(qū)域內(nèi)尋找到新
8、的標記引物，就不需要把所有的個體跑樣，只需要跑重組子個體例：篩選重組子的目的Rf
