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《微衛(wèi)星DNAPCR擴(kuò)增結(jié)果示例.ppt》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、基因診斷GeneDiagnosis譚湘陵南通醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)系遺傳學(xué)教研室基因診斷的概念—直接在DNA或RNA水平上進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能檢測，從而輔助臨床進(jìn)行的診斷?；蛟\斷是近年來臨床醫(yī)學(xué)中發(fā)展十分迅速的一類嶄新的診斷技術(shù)，它依托DNA重組技術(shù)，從基因型入手，診斷表現(xiàn)型。（逆向診斷）基因診斷始于1978年，Kan第一次成功進(jìn)行了鐮狀細(xì)胞貧血病的產(chǎn)前基因診斷?；蛟\斷具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、費用低，并對許多疾病特別是遺傳性疾病具有預(yù)測性的特點，是一種極具潛力的診斷方法。由于基因診斷的發(fā)展時間還不長，人類對基因的了解還有許多空白，因此許多疾
2、病的診斷還主要依賴于傳統(tǒng)的方法，但隨著分子遺傳學(xué)、分子生物學(xué)，特別是人類基因組計劃的完成，基因診斷將顯示出強(qiáng)大的生命力。傳統(tǒng)的診斷（舉例）：１、問、望、聽、觸???經(jīng)驗型診斷２、化驗/檢驗—材料：細(xì)胞、組織、大分子、小分子、代謝/排泄物等。方法：細(xì)胞學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)等。３、影像學(xué)—X光、B超、CT、核磁共振、內(nèi)窺鏡等。４、特殊檢查—染色體檢查、肌電/心電/腦電、骨密度等。在醫(yī)學(xué)發(fā)展的過程中，這些方法發(fā)揮了巨大作用，隨著技術(shù)水平的發(fā)展，這些方法也在不斷提高和完善，也還會有其他新的診斷方法的問世。這些診斷有一個無
3、法逾越的鴻溝：預(yù)測也就是說“發(fā)病”了才能診斷?；蛟\斷的對象1、病原生物的侵入，如流感、肝炎、艾滋病2、單基因遺傳性疾病，如苯丙酮尿癥、無丙種球蛋白血癥3、多基因疾病，如腫瘤、高血壓4、其它，如親子鑒定、個體識別、法醫(yī)物證遺傳標(biāo)記1、第一代遺傳標(biāo)記—限制性酶切片段長度多態(tài)性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)8kb5kb3kb在個體和群體中，片段長度表現(xiàn)出多態(tài)性。如3kb,5kb,7kb,8kb…RFLP呈現(xiàn)孟德爾式遺傳。常用檢查方法：核酸雜交；PCR-酶切等。產(chǎn)生多態(tài)性的原因是
4、內(nèi)切酶位點的變化。原位點的消失；新位點的產(chǎn)生。GAATTC CTTAAGGATTTC CTAAAG1212III2kb3kb5kb7kb2、第二代遺傳標(biāo)記—微衛(wèi)星DNA(Micro-satelliteDNA)屬高度重復(fù)序列，重復(fù)單元2~6bp，重復(fù)區(qū)大多幾十~幾百bp，分散在基因組中，大多不存在于編碼序列內(nèi)，具有較高的多態(tài)性。呈現(xiàn)孟德爾式遺傳。目前微衛(wèi)星DNA已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了２萬余個位點。TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGCAAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG常用檢
5、查方法：PCR等。微衛(wèi)星DNAPCR擴(kuò)增結(jié)果（示例）：500bp400bp300bp240bp該結(jié)果顯示在所檢查的人群中，該位點多態(tài)性有4種。微衛(wèi)星DNA差異最小只相差2個堿基（重復(fù)片段只有2個堿基）。2、第三代遺傳標(biāo)記—單核苷酸多態(tài)性(SNP)某些DNA位點上，單個堿基存在著變化。如：AATGGCGTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCAGCTAATGGCCTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCTGCTAATGGCATAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCGGCT個體A個體B個體CSNP分布于整個基因
6、組，可在基因內(nèi)，也可在基因間。估計每1000個bp存在一個。在人類DNA序列變異中，SNP占90%。單個堿基的插入和缺失不認(rèn)為是SNP。目前已知基因組中含有150萬個SNP對于人類來說，SNP的意義在于：１、致病SNP２、疾病易感性SNP３、具有診斷價值的SNP４、疾病的SNP譜５、人表型相關(guān)SNP６、藥物作用與不良反應(yīng)的SNP７、藥物劑量SNP目前SNP研究的兩個熱點：１、cDNA上的SNP（cSNP）２、啟動子上的SNP芯片雜交結(jié)果示意圖ACGT位點1位點2位點3常用檢查方法：DNA測序、芯片雜交等。基因變異的類型1、點突變—
7、１）單個堿基置換２）單個堿基的缺失或插入2、片段缺失—編碼片段；調(diào)節(jié)序列3、片段插入—編碼片段；調(diào)節(jié)序列4、重排—融合基因5、擴(kuò)增—拷貝大量增加6、動態(tài)突變—遺傳物質(zhì)傳遞過程中不等交換使STR重復(fù)數(shù)增加基因診斷的技術(shù)方法Southern雜交Northern雜交Western印跡中蛋白電泳PCR原理PCR原理１變性PCR原理１復(fù)性PCR原理１延伸PCR原理２變性PCR原理２復(fù)性PCR原理２延伸PCR原理３變性PCR原理３復(fù)性PCR原理３延伸DNA以指數(shù)形式擴(kuò)增(2n)，其中長片段以線性形式擴(kuò)增(2n+2)，最終主產(chǎn)物片段長度在兩個引
8、物之間。預(yù)變性(92-95?C,2-5m)變性(92-95?C,30s)復(fù)性(40-60?C,30s)延伸(72?C,30-60s)總延伸(72?C,7m)(25-35)PCR的一般過程：經(jīng)過30次的循環(huán),擴(kuò)增的DNA片段可達(dá)100萬倍以上。240
