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1、酵母雙雜交系統(tǒng)及其應用YeastTwo-hybridSystemandItsApplication1.釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的生物學特性（1）單細胞真核生物盡管酵母細胞比較簡單，但它們具有所有真核生物細胞的主要特征，如含有一個獨立的細胞核、多條線性染色質包裝成染色體、細胞質包含了全部的細胞器和細胞骨架結果（如肌動蛋白纖維）。（2）與其它真核生物相比，它們的基因組較小，基因數(shù)目也較少；1996年已完成酵母全基因組測序（1.5x107bp），是第一個被測序的真核生物。大約有6000個基因。目前已經建立了一個6000
2、個菌株的文庫，每一個菌株中只刪除了一個基因。其中5000多株在單倍體狀態(tài)時能夠存活，表明大多數(shù)酵母基因時非必需的。（3）易于培養(yǎng)和操作,可以在實驗室快速繁殖在指數(shù)生長期每90分鐘繁殖一代，從單個細胞可以繁殖稱克隆群體。（4）單倍體和雙倍體的存在使釀酒酵母便于進行遺傳分析釀酒酵母可以以單倍體狀態(tài)和雙倍體狀態(tài)生長。單倍體和雙倍體之間的轉換是通過交配和孢子形成來實現(xiàn)的。有兩種單倍體細胞類型，分別為a型和α型。在一起生長時，這些細胞因交配而形成a/α雙倍體細胞。在營養(yǎng)匱乏時，a/α雙倍體發(fā)生減數(shù)分裂，產生一個子囊的結構，每個子囊含有4個單倍體孢子（兩個a
3、－孢子和兩個α－孢子）。但當生長條件改善時，這些孢子可以出芽并以單倍體細胞的形式生長或交配而重新形成雙倍體。(5)一個酵母細胞可同時兼容幾種不同質粒vegetative，營養(yǎng)體生殖的，無性生殖的：屬于或關于無性生殖，如裂殖或芽殖的bud，芽,蓓蕾starvation，饑餓,餓死ascus，n.[微生物]子囊meiosis，n.減數(shù)分裂,成熟分裂haploid，n.[生物]單倍體,僅有一組染色體的細胞adj.單一的diploid，adj.雙重的,倍數(shù)的,雙倍的n.倍數(shù)染色體ascospore，n.[植]囊孢子rupture，v.破裂,裂開,斷絕(關
4、系等),割裂。n.破裂,決裂,敵對,割裂spore，n.孢子vi.長孢子germinate，v.發(fā)芽,發(fā)育,使生長12釀酒酵母生活周期2酵母雙雜交系統(tǒng)的原理蛋白質的相互作用是生命活動的基礎，一切生命活動幾乎都是通過蛋白質之間的相互作用而實現(xiàn)的。在生物體發(fā)育的不同階段，細胞分裂、分化的不同時期，都離不開蛋白質間的相互作用。酵母雙雜交系統(tǒng)是一種采用分子遺傳學手段、通過鑒定報告基因的轉錄活性檢測蛋白質－蛋白質相互作用的方法。Y2H是由紐約州立大學的StanleyFields于1989年首先創(chuàng)立的。轉錄激活因子在結構上是組件式的(modular),即這些
5、因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結構域構成。lDNA結合結構域(DNAbindingdomain,DB)l轉錄激活結構域(activationdomain,AD)例如，酵母轉錄子Gal4分子由一條多肽鏈組成，含有881個氨基酸。它有兩個結構域：lDNA結合結構域（DNAbindingdomain,DB）由位于N-末端1~147個氨基酸構成，能識別效應基因的上游激活序列（UAS,upstreamactivatingsequence）,此外，在其N-端還具有一段核定位序列；l轉錄激活結構域（activationdomain,AD）由位于C-末端的7
6、68~881位氨基酸構成。當Gal4的兩個結構域位于不同肽鏈上，只要它們在空間上充分接近，則能夠恢復Gal4作為轉錄因子的活性。12Fields等將Snf1與DB融合，Snf4與AD融合，構建在穿梭質粒上。其中，Snf1是一種依賴于絲氨酸、蘇氨酸的蛋白激酶，Snf4是它的一個結合蛋白。研究者將兩種穿梭質粒轉化酵母GGY:171菌株，該菌株含有LacZ報告基因，并已去除相應轉錄因子基因。該實驗的結果表明由Snf1和Snf4相互作用使得AD和BD在空間上接近，激活了報告基因LacZ的轉錄。一般地，將DB-x的融合蛋白稱作誘餌(bait),X往往是已知
7、蛋白;AD-Y稱作獵物(prey),Y稱作獵物;整個實驗過程稱作“狩獵”(hunt或fish)。3酵母雙雜交系統(tǒng)的應用目前,在許多具有國際水準的實驗室中,酵母雙雜交系統(tǒng)及其衍生方法已成為研究蛋白質相互作用的首選方法,而且利用它已揭示了大量未知蛋白質的相互作用。據(jù)對文獻的統(tǒng)計,目前已知的蛋白質相互作用至少有一半是通過酵母雙雜交實驗發(fā)現(xiàn)的。年份899091929394959697文獻數(shù)量10151558124223226年份989900010203040598文獻數(shù)量274340612736766744745671274l鑒定兩種已知蛋白之間有無相互
8、作用l鑒定已明確有相互作用蛋白質發(fā)生作用所必需的的結構域及特定氨基酸的改變對相互作用的影響l尋找與某一特定蛋白質有相互作用的蛋白質l蛋白
