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1、分子克隆技術(shù)龜叔第一部分：填空1?質(zhì)粒的三種狀態(tài)：超螺旋，開環(huán)，線型2.DNA純度：吸光值檢測(cè)：檢測(cè)260nin、280nm吸光值，紫外分光光度計(jì)A26a/A280=1.8-1?9；1?8最佳，低于1?8說(shuō)明有蛋白質(zhì)，大于1?8說(shuō)明有RNAO3?分光光度計(jì)：lOD=5()ug/mlDS-DNA或l()D=40ug/mlRNAorSS-DNA4?幾種工具酶:限制性內(nèi)切酶，堿性磷酸酶，連接酶5.限制酶的一個(gè)活性單位(1U):原則上指在5幕1反應(yīng)體系中，37C下，經(jīng)過(guò)1小時(shí)的反應(yīng)將1pg的DNA完全分解所需要的酶量
2、?6?引起星星活性的因素：高濃度的甘油(>5%)；?酶過(guò)量(>10()U/ug)；?低離子強(qiáng)度(v25mM)；?高pH(>pH8.0)；?有機(jī)溶劑(DMSO,乙醇，乙二醇，二甲基乙酰胺；?用其他二價(jià)陽(yáng)離子代替Mg2+(Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+)6.DNA酶切不完全的主要原因有：dna中有酶抑制劑，甲基化；操作不標(biāo)準(zhǔn)，反應(yīng)條件不合適；酶活力不夠。7.DNA樣品中抑制酶活的污染物主要有：蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高濃度的鹽等均能抑制酶切活性。解決方法：純化DNA,增加酶作用的單位數(shù)，
3、增大反應(yīng)體積稀釋抑制劑，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間,加入聚陽(yáng)離子亞精胺。8.DNA的回收純化:1?低熔點(diǎn)瓊脂糖2?透析帶電洗脫法3.glassmilk純化4.柱回收試劑盒9.地高辛(DIG)是靈敏度高、非放射性核酸標(biāo)記檢測(cè)體系。dig檢測(cè)靈敏度接近同位素而無(wú)放射性危險(xiǎn)、相比熒光則不需要特殊檢測(cè)設(shè)備，相比生物素則沒(méi)有樣本內(nèi)源干擾之苦，很適合用于核酸非放標(biāo)記檢測(cè)。第二部分：簡(jiǎn)答1、SolutionK2、3的作用solutionI重懸細(xì)菌solutionIL其中的SDS［壞細(xì)胞壁、膜，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來(lái)，NaOH使DNA變性、
4、堿基對(duì)打開，使宿主染色體DNA雙鏈分開，而閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)，兩個(gè)環(huán)并不分開SolutionIII中和后，宿主DNA由于很大，堿基還未來(lái)得及配對(duì)就在冰冷的條件下與SDS、蛋白質(zhì)、高分子量的RNA等纏繞在一起沉淀下來(lái)，而質(zhì)粒DNA由于很小且雙鏈未分開，能夠迅速配對(duì)重新形成超螺旋，處于溶解狀態(tài)2、移液器的使用注意事項(xiàng)a設(shè)定移液體積，裝配移液槍頭。b垂直吸液，慢吸慢放c吸有液體的移液槍不宜平放。d使用后調(diào)回最大量程，放回3、尼龍膜、硝酸纖維素膜的異同點(diǎn)尼龍膜更多是用于核酸的轉(zhuǎn)移，也有見于蛋白印跡，
5、比如dotblot,比較于NC膜來(lái)說(shuō)，它的優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合力強(qiáng)，特結(jié)實(shí)又柔軟且不易卷曲，機(jī)械強(qiáng)度大，便于操作，缺點(diǎn)是背景高—由于尼龍膜電荷密度高，使得非結(jié)合區(qū)的封閉比疏水性NC膜困難，對(duì)于靈敏度高的檢測(cè)方法，背景問(wèn)題尤為突出（據(jù)分子克隆III說(shuō)通過(guò)熱處理的酪蛋白和1%聚乙烯毗咯烷酮延長(zhǎng)封閉時(shí)間可以改善），而且當(dāng)轉(zhuǎn)移緩沖液中存在有SDS時(shí)蛋白質(zhì)就容易從尼龍膜上泄漏（通過(guò)甲醛固定可以緩解這一情況）。硝酸纖維素膜是蛋白印跡最廣泛使用的轉(zhuǎn)移介質(zhì)，對(duì)蛋白有很強(qiáng)的結(jié)合能力，而且適用于各種顯色方法，NC膜很容易封閉，也不需要特別
6、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)那逑礂l件。轉(zhuǎn)移到NC膜上的蛋白在合適的條件下可以穩(wěn)定保存很長(zhǎng)時(shí)間，不過(guò)要注意的是純的硝纖膜在比較脆，又容易卷，操作要小心，不適合用于需要多次重復(fù)清洗的用途——因?yàn)榻?jīng)不起多次“折磨I
7、nc膜尼龍膜靈敏度和分辨率低恢高結(jié)合能力80-110ug/cm2>400ug/cm2林料質(zhì)地干的NC膜易脆秋而結(jié)實(shí)粋劑耐受性無(wú)無(wú)快作程序緩沖液祠濕，避免氣泡緩沖液祠濕檢測(cè)方式當(dāng)規(guī)染色，可用放射性和非放射性檢則不能用陰離子染料適用范國(guó)0.45um—般蛋白0.2um—分子里小于20kD蛋白O.lum—分子里小于7kD蛋白低濃度小
8、分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖（主要用在核酸檢則中）價(jià)格價(jià)格較便宜便宜4、雜交、預(yù)雜交的注意事項(xiàng)預(yù)雜交及雜交時(shí)保證buffer覆蓋膜如果尼龍膜要多次探測(cè)，務(wù)必保證在任何時(shí)候都不要讓尼龍膜干燥使用正確的雜交溫度（使用DIGEasyHvb,DNA：DNA37—42°C,RNA：RNA68°C,RNA：DNA50°C)■為防止尼龍膜干燥，在準(zhǔn)備好下一步處理用試劑之前不要倒掉正在用的溶液■使用合適的探針濃度■探針用之前變性■如果探針與靶DNA的同源性低于80%,熱洗時(shí)應(yīng)使用較低的溫度（如60°C)■熱洗之前應(yīng)將
9、洗膜液預(yù)熱到熱洗所需溫度5、如何判斷提取的RNA的質(zhì)量1）檢測(cè)RNA溶液的吸光度280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機(jī)物的值。一般的,我們只看OD260/OD280（Ratio,R）,1.8-1.92）瓊脂糖凝膠電泳：電泳的目的是在于檢測(cè)28S和18S條帶的完整性和他們的比值，或者是mRNAsmear的完整性。一般的，如果28S和18S條帶
