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《獼猴桃、棗高效再生體系的建立及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究.docx》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、獼猴桃、棗高效再生體系的建立及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究獼猴桃(Actinidia)果實(shí)風(fēng)味獨(dú)特,營(yíng)養(yǎng)豐富,被譽(yù)為“水果之王”。棗(ZizyphusjujubaMill.)是我國(guó)第一大干果樹(shù)種。獼猴桃屬雌雄異株,遺傳背景復(fù)雜；棗花蕾小、自然坐果率低、胚敗育率高等因素,傳統(tǒng)雜交育種方法存在周期長(zhǎng)、效率低等問(wèn)題,獲得優(yōu)質(zhì)多抗的獼猴桃、棗新品種困難重重?；蚬こ痰陌l(fā)展為獼猴桃、棗的育種工作開(kāi)辟了一條新的途徑。本研究以河南特異紅果肉獼猴桃資源中華獼猴桃‘伏牛95-2’(Actinidiachinensis’Funiu95-2’)為材料,建立了中華獼
2、猴桃‘伏牛95-2’高效再生體系、遺傳轉(zhuǎn)化體系,且獲得了轉(zhuǎn)抗菌肽D基因的轉(zhuǎn)基因植株,PCR檢測(cè)、Southern雜交檢測(cè)證明外源基因已整合到獼猴桃基因組中?；覘椷z傳轉(zhuǎn)化研究,本試驗(yàn)以灰棗(Zizyphusjujuba’Huizao’)為材料建立了灰棗組培快繁體系、葉片直接再生體系及對(duì)灰棗遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行了初步探討。主要結(jié)果如下：1.以中華獼猴桃‘伏牛95-2’葉片為外植體,探討了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)葉片再生不定芽增殖及生根的影響,建立了高效的再生體系。結(jié)果表明,葉片外植體在MS+ZT1.0mg/L+NAA0.3mg/L培養(yǎng)基上,不定芽分化率
3、最高為87.5%；在MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L培養(yǎng)基中,不定芽增殖系數(shù)最高為4.2；適宜不定芽生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA2.0mg/L,生根率為100%。2.以中華獼猴桃‘伏牛95-2’葉片為外植體,研究了抗生素對(duì)外植體生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明,中華獼猴桃‘伏牛95-2’對(duì)卡那霉素較敏感,濃度20mg/L時(shí)愈傷組織及不定芽分化率均為0,20mg/L為中華獼猴桃‘伏牛95-2’葉片遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)篩選最佳濃度；生根培養(yǎng)基中附加30mg/L卡那霉素時(shí),則完全抑制根的形成。頭孢霉素和羧芐青霉素對(duì)中華獼猴桃‘伏牛95-2’葉片分
4、化均有抑制作用,但頭孢霉素對(duì)葉片分化的抑制作用比羧芐青霉素??；結(jié)合遺傳轉(zhuǎn)化中的抑菌試驗(yàn),選用400mg/L頭孢霉素為中華獼猴桃‘伏牛95-2’遺傳轉(zhuǎn)化中適宜抑菌抗生素及濃度。3.以中華獼猴桃‘伏牛95-2’葉片作為根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的受體材料,建立了高效遺傳轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果表明,葉片預(yù)培養(yǎng)3天,菌液濃度OD600值為0.3,真空滲入方式侵染10min,共培養(yǎng)4天條件下,GUS基因瞬時(shí)表達(dá)率最高,達(dá)到92.2%。對(duì)轉(zhuǎn)基因抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)和GUS組織化學(xué)染色,初步證明外源基因已整合到中華獼猴桃‘伏牛95-2’的基因組中。4.以中華獼猴桃‘伏牛
5、95-2’葉片為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,對(duì)共培養(yǎng)后抗性芽的篩選方式進(jìn)行了研究,并對(duì)獲得的轉(zhuǎn)抗菌肽D基因的抗性植株進(jìn)行了分子生物檢測(cè)。結(jié)果表明,逐步提高卡那霉素選擇壓力與保持卡那霉素選擇壓力不變相比,抗性芽獲得率提高了28.4%；部分抗性植株經(jīng)PCR、PCR-Southern、Southern雜交檢測(cè),外源基因已整合至獼猴桃基因組中。5.以灰棗一年生棗頭莖段為材料,對(duì)啟動(dòng)培養(yǎng)時(shí)抗生素對(duì)污染的抑制,不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)莖段啟動(dòng)、不定芽增殖及生根的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,大田采樣時(shí),以70%酒精滅菌30s,再以0.1%HgCl2滅菌10～15m
6、in后污染率依然高達(dá)97.8%；培養(yǎng)基中添加150mg/L或200mg/L頭孢霉素可使污染率降為0；莖段接種于MS+KT2.0mg/L+NAAO.lmg/L培養(yǎng)基中獲得的粗壯棗頭較多。莖段萌發(fā)的腋芽接種于Ms+KT2.0mg/L+NAA0.3mg/L培養(yǎng)基中,棗苗長(zhǎng)勢(shì)壯、葉片大、葉深綠；而接種于Ms+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L培養(yǎng)基中,組培苗較弱,增殖系數(shù)較高為2.7。將繼代增殖的再生芽接種在生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根,最佳的生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.5mg/L,培養(yǎng)40d時(shí)生根率達(dá)95.56%。6.以灰棗組培苗葉片為
7、材料,研究了不同葉片來(lái)源、碳源、葉片放置方式、暗培養(yǎng)時(shí)間、乙烯抑制劑等處理對(duì)葉片再生的影響。結(jié)果表明,葉片直接再生不定芽的適宜培養(yǎng)基為WPM+TDZ0.5mg/L+NAA0.2mg/L；最佳葉片來(lái)源為灰棗組培苗中部平展,大而厚葉片；近葉柄處再生率比近葉尖處高59.74%；以遠(yuǎn)軸面接觸培養(yǎng)基葉片再生率較高為69.61%；蔗糖濃度為40g/L可降低再生芽的玻璃化程度；葉片暗培養(yǎng)時(shí)間以10d葉片再生率較高為81.6%；0.5mg/LAgNO3和0.1mg/L的STS均提高了灰棗葉片再生率,再生率分別為82.25%,91.26%。7.以灰棗葉片為
8、受體,研究了卡那霉素對(duì)葉片再生的影響、頭孢霉素的抑菌效果及不同共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果表明,當(dāng)灰棗葉片再生培養(yǎng)基中添加40mg/L卡那霉素能抑制不定芽的分化,40mg/L為灰棗遺傳轉(zhuǎn)化中
