尿素柱層析法分離共軛亞油酸異構(gòu)體的研究

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1、尿素柱層析法分離共軛亞油酸異構(gòu)體的研究摘要研究了負載型尿素層析柱分離共軛亞油酸甲酯異構(gòu)體過程中的影響因素，考察了甲醇殘留量，尿素與硅膠的比例，不同溫度下結(jié)晶的固定相，不同過柱溫度，不同流動相及負載溶劑對分離效果的影響，得到最佳條件下分離效果為10反12順共軛亞油酸含量從原料的40%提高到59%。關(guān)鍵詞尿素柱層析共軛亞油酸甲酯異構(gòu)體前言尿素柱層析法是利用被分離鏈狀分子在尿素負載固定相和流動相之間的分配平衡常數(shù)的差異，經(jīng)過多次分配平衡實現(xiàn)分離目的的，侯相林等[1]利用尿素柱層析分離制得含量為83%以上的α-亞麻酸乙酯，證明尿素柱層析法對不同雙鍵數(shù)的鏈狀分子具有較好的分離效果，而發(fā)

2、明專利（￥￥￥）報道尿素柱層析法可以很好的分離順式油酸和反式油酸，說明在尿素柱層析分離過程中，反式油酸較順式油酸更容易保留在固定相中，反式油酸和尿素的結(jié)合穩(wěn)定性更接近飽和脂肪酸。而文獻####研究了神經(jīng)酸和芥酸在尿素柱層析中的分離行為，證明脂肪酸飽和尾鏈的長短是決定與尿素結(jié)合穩(wěn)定重要因素，而KlareSMarkley等發(fā)現(xiàn)不飽和脂肪酸與尿素的結(jié)合穩(wěn)定性常數(shù)和脂肪酸分子截面影響較大，脂肪酸分子橫截面越大包藏越困難，而不飽和雙鍵越多分子截面越大。共軛亞油酸是亞油酸共軛化的產(chǎn)物，亞油酸兩個順式雙鍵中的一個在共軛化過程中會發(fā)生位移，同時順式雙鍵轉(zhuǎn)化為反式雙鍵。共軛亞油酸主要是（順9，

3、反l1）二烯酸和（l0反，12順）二烯酸的混合物。這兩種異構(gòu)體所具有的生理功能有很大差異，為了更好的發(fā)揮其各自的優(yōu)異功能，有必要將兩種異構(gòu)體進行分離。目前大都是將亞油酸從其他脂肪酸中純化的方法，沒有針對共軛亞油酸異構(gòu)體分離的直接方法，已經(jīng)做的比較好的方法有尿素包合法，該法雖然成本較低，但存在收率低，污染嚴重等問題；無溶劑尿素包合+超臨界CO2萃取技術(shù)+冷凍分離方法分離兩種異構(gòu)體，工藝復(fù)雜，成本高，產(chǎn)業(yè)化困難也有利用假絲酵母脂肪酶兩步選擇性酯化和分子蒸餾相結(jié)合，該方法雖然分離效果很好，但是成本高，收率低，難于產(chǎn)業(yè)化。尿素柱層析的優(yōu)點：常壓低溫下實現(xiàn)各種脂肪酸的分離，能夠比較完整

4、的保留各脂肪酸的功效與生理功能。工藝簡單、產(chǎn)品純度高、操作成本低、甲醇和尿素用量少、易于回收、綠色環(huán)保、易于產(chǎn)業(yè)化。1實驗材料與方法1.1主要材料與試劑無水甲醇、石油醚、尿素、無水硫酸鎂、濃硫酸均為分析純；柱層析硅膠、共軛亞油酸樣品（油酸13.1%、c9，tl1～CLA32%、c12，tl0～CLA40.3%、其他CLA14.6%）。1.2設(shè)備與儀器層析柱（2×60）cm；自動控溫水浴裝置；磁力攪拌器；真空干燥箱；減壓蒸餾裝置；電子天平：上海恒平；HXSPGC-950氣相色譜儀。1.3實驗方法1.3.1共軛亞油酸的甲酯化處理在100ml無水甲醇中加入3ml濃硫酸，將20g共軛

5、亞油酸樣品加入其中，50℃水浴回流5h，減壓蒸餾脫除甲醇后，用石油醚和水（1：1，V/V）萃取分液，有機相用蒸餾水洗至中性，無水硫酸鎂干燥，過濾，減壓蒸餾脫除石油醚，得到共軛亞油酸甲酯。1.3.2柱層析固定相的制備稱取一定量尿素和甲醇并在60℃下完全溶解，加入一定量的柱層析用硅膠，在此溫度下攪拌10min，冷卻至室溫后，將下層硅膠翻動與上層尿素晶體混合，放入冰箱上層。取出后抽濾去除甲醇，并置于真空烘箱中烘干。1.3.3固定相中溶劑殘留量的檢測精確移取2mL蒸餾水于八個試管中（容量瓶），分別加入3μL、5μL、10μL、25μL、50μL、75μL、100μL、125μL無水甲

6、醇，在柱溫100℃，汽化室和檢測室150℃的色譜條件下（檢測器），進樣量3μL、，得到甲醇體積與峰面積的線性關(guān)系曲線：y=0.9532x，線性度R2=0.9972。準確稱取0.5g固定相，加入2Ml蒸餾水，充分搖動，過濾，濾液景象氣相色譜分析，進樣量3μL。以經(jīng)過換算得到的線性曲線w%=0.1906A作為溶劑殘留量大小的比較依據(jù)。其中：w為固定相中甲醇的質(zhì)量分數(shù)，A為色譜圖中甲醇峰面積。1.3.4裝柱稱取60g柱層析固定相放入石油醚中浸泡、攪動除去其中的氣泡；帶氣泡驅(qū)除完全，濕法裝入層析玻璃管柱中，制備成負載型尿素層析柱。1.3.5尿素柱層析分離共軛亞油酸甲酯取一定量的共軛亞

7、油酸甲酯，加入到層析柱上層，以石油醚為洗脫劑洗脫，每10mL收集一個洗脫份，對洗脫份進行色譜分析，確定共軛亞油酸各異構(gòu)體含量。1.3.6共軛亞油酸異構(gòu)體的檢測初溫200℃，汽化室和檢測室溫度為230℃，TL9900色譜工作站，氫火焰檢測器，峰面積歸一化法計算共軛亞油酸甲酯的相對含量。檢測方法？？？？？？2結(jié)果與討論2.1共軛亞油酸甲酯原料的組成甲酯化后的共軛亞油酸樣品進行氣相色譜分析，得到共軛亞油酸樣品組成如圖1，A1為油酸15.46%，A2為c9，t11共軛亞油酸31.37%，A3為t10，c12共軛