親和層析法ppt課件

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親和層析法

1親和層析法的基本介紹操作過程親和層析法的應(yīng)用主要內(nèi)容制備方法

21、生物親和作用生物物質(zhì)具有識別特定物質(zhì)并與該物質(zhì)的分子相結(jié)合的能力。這種識別并結(jié)合的能力，能區(qū)分結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常相近的其它分子。如蛋白酶與輔酶、抗原和抗體、激素與其受體等體系。由于分離方法的特異性不強(qiáng)，導(dǎo)致分離純化的收得率較低；為了解決這一問題，一種有效的分離方法應(yīng)運(yùn)而生——親和層析(AffinityChromatography，AC)，利用被分離的生命大分子物質(zhì)和特異性配體之間能可逆性結(jié)合與解離的原理而建立的層析方法。在親和層析中，作為固定相的一方稱為配基。配基必須偶聯(lián)于不溶性母體上。母體又稱為載體或擔(dān)體，一般采用瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝照、聚丙烯酰胺凝膠和纖維素等。

32、親和作用的機(jī)理結(jié)構(gòu)特點(diǎn)鑰匙和鎖孔的關(guān)系相互作用力靜電作用、氫鍵、疏水性相互作用、配位鍵、弱共價(jià)鍵等。影響親和作用的因素離子強(qiáng)度、pH值、抑制氫鍵形成的物質(zhì)、溫度、液體離子、螯合劑等。

4親和層析載體的組成配體以共價(jià)鍵結(jié)合到活化的基質(zhì)上，構(gòu)成固相載體。原理親和的一對分子中的一方以共價(jià)鍵形式與不溶性載體相連作為固定相吸附劑；當(dāng)含有混合組份的樣品（流動(dòng)相）通過此固定相時(shí)，只有和固定相分子有特異親和力的物質(zhì)，才能被固定相吸附結(jié)合，其它沒有親和力的無關(guān)組份就隨流動(dòng)相流出；然后改變流動(dòng)組成份，將結(jié)合的親和物洗脫下來。

53、特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：上樣量大，純化過程簡單、迅速，且分離效率高，被分離物質(zhì)的活性不易喪失。特別適用于分離純化一些含量低、穩(wěn)定性差的生物大分子。缺點(diǎn)：每分離一種物質(zhì)都必須找到合適的配體，并將其制備成固相載體，在洗脫中，交聯(lián)在層析介質(zhì)上的配基可能脫落并進(jìn)入產(chǎn)品中，從而造成不良影響，如抗體、染料等配基。成本相對較昂貴。

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8金屬離子親和層析金屬離子親和層析是利用金屬離子的絡(luò)合物或形成螯合物的能力吸附蛋白質(zhì)的分離系統(tǒng)，目的蛋白質(zhì)表面暴露的供電子氨基酸殘基，如組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚基，十分有利于蛋白質(zhì)與固定化金屬離子結(jié)合，這是用于蛋白質(zhì)分離純化的根據(jù)。金屬離子如鋅和銅，已發(fā)現(xiàn)能很好地與組氨酸的咪唑基及半胱氨酸的巰基結(jié)合，含有不同數(shù)量的這些基團(tuán)的蛋白質(zhì)可以通過金屬離子親和層析得到分離。擬生物親和層析利用部分分子相互作用，模擬生物分子結(jié)構(gòu)或某特定部位，以人工合成的配基為固定相吸附目的蛋白質(zhì)的親和層析。

9親和層析的基本原理操作過程親和層析的應(yīng)用主要內(nèi)容制備方法

101、載體的選擇一般情況下，需根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物選擇合適的親和配基來修飾載體，以制備所需的親和吸附介質(zhì)即固定相。作為載體的物質(zhì)應(yīng)具有：①不溶性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，滲透性好；②物理和化學(xué)穩(wěn)定性高，有較高的機(jī)械強(qiáng)度，使用壽命長；③抗微生物和酶的侵蝕；④最好為粒徑均一的球形粒子；⑤具有親水性，無非特異性吸附；⑥含有可活化的反應(yīng)基團(tuán)，利于親和配體的固定化。例：瓊脂糖凝膠微球的商品名為Sepharose，含糖濃度為2%、4%、6%時(shí)分別稱為2B、4B、6B。Sepharose4B的結(jié)構(gòu)比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B應(yīng)用最廣。

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122、配體的選擇一對可逆結(jié)合的生物分子中與載體相偶聯(lián)的一方稱配體。如抑制劑、底物、抗體、輔酶等。依據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)配體要考慮兩個(gè)重要因素：正確地預(yù)計(jì)被設(shè)計(jì)的配體構(gòu)像正確預(yù)計(jì)配體的親和力優(yōu)良配體須具備的條件：與待純化的物質(zhì)有較強(qiáng)的親和力。一般來說，配體對大分子物質(zhì)的親合力越高，在親和層析時(shí)，分辨率就越好，應(yīng)用價(jià)值就越高；但若配體與待純化物質(zhì)（生物大分子物質(zhì)）之間的親合力太大時(shí)，對分離純化是不利的。

13②具有與基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的基團(tuán)與待分離物質(zhì)有適當(dāng)?shù)挠H和力，而與樣品中其它組分沒有明顯的親和力，對其它組分沒有非特異性吸附作用。③配體要能夠與基質(zhì)穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合在實(shí)驗(yàn)過程中不易脫落，并且配體與基質(zhì)偶聯(lián)后，對其結(jié)構(gòu)沒有明顯改變，尤其是偶聯(lián)過程不涉及配體中與待分離物質(zhì)有親和力的部分，對二者的結(jié)合沒有明顯影響。④配體自身應(yīng)具有較好的穩(wěn)定性在實(shí)驗(yàn)中能夠耐受偶聯(lián)以及洗脫時(shí)可能的較劇烈的條件，可以多次重復(fù)使用。

14根據(jù)配體對待分離物質(zhì)的親和性的不同，可以將其分為兩類：特異性配體（specificligand）和通用性配體（generalligand）。特異性配體一般是指只與單一或很少種類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體。如生物素－親和素、抗原－抗體、酶－抑制劑、激素－受體等，它們結(jié)合都具有很高的特異性。通用性配體一般是指特異性不是很強(qiáng)，能和某一類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體，如各種凝集素可以結(jié)合各種糖蛋白等。通用性配體對生物大分子的專一性雖然不如特異性配體，但通過選擇合適的洗脫條件也可以得到很高的分辨率。而且這些配體還具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、偶聯(lián)率高、吸附容量高、易于洗脫、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，所以在實(shí)驗(yàn)中得到了廣泛的應(yīng)用。

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16親和層析的基本原理操作過程親和層析的應(yīng)用主要內(nèi)容制備方法

17層析前：制備親和層析劑選擇根據(jù)欲分離物質(zhì)特性配基選擇根據(jù)配基分子大小及基團(tuán)特性載體洗脫：削弱目的產(chǎn)物和親和吸附配體間的相互作用。包括：非專一性洗脫和專一性洗脫偶聯(lián)親和層析劑1、操作流程

18非專一性洗脫：改變溫度改變pH值改變離子強(qiáng)度專一性洗脫：競爭性洗脫劑（半抗原、抑制劑、底物類似物）被吸附物質(zhì)結(jié)合競爭性地與配體結(jié)合

192、基質(zhì)活化當(dāng)用小分子化合為作為配體時(shí)，由于空間位阻作用，難于與配對的大分子親和吻合，常在母體與配體之間引入適當(dāng)長度的連接臂。要使不溶性母體與配體偶聯(lián)或通過連接臂與配體偶聯(lián)，必須先使母體活化。即使母體引入某一活潑的基團(tuán)，才能以共價(jià)鍵與配體偶聯(lián)。基質(zhì)的活化是指通過對基質(zhì)進(jìn)行一定的化學(xué)處理，使基質(zhì)表面上的一些化學(xué)基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)橐子诤吞囟ㄅ潴w結(jié)合的活性基團(tuán)。不同的載體活化需要不同的活化劑。常用：溴化氰（CNBr）、環(huán)氧氯丙烷、1,4-丁二醚、戊二醛、高碘酸鹽、苯醌等。

20活化溴化腈活化法溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化過程主要是生成亞胺碳酸活性基團(tuán)，它可以和伯氨（NH2）反應(yīng)，主要生成異脲衍生物。反應(yīng)如下：缺點(diǎn)：基質(zhì)和配體偶聯(lián)后生成的異脲衍生物中氨基的pKa＝10.4，所以通常會(huì)帶一定的正電荷，從而使基質(zhì)可能有陰離子離子交換作用，增大了非特異性吸附，影響親和層析的分辨率。另外溴化氰活化的基質(zhì)與配體結(jié)合不夠穩(wěn)定，尤其是當(dāng)與小配體結(jié)合時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)配體脫落現(xiàn)象。另外溴化氰有劇毒、易揮發(fā)，所以操作不便。

21環(huán)氧基活化法在熱的濃堿溶液中，多糖類化合物與環(huán)氧氯丙烷作用生成環(huán)氧化合物；在堿性條件下，其環(huán)氧化合物又能與氨基酸或蛋白質(zhì)上氨基偶聯(lián)。優(yōu)點(diǎn)：活化后不引入電荷基團(tuán)，而且基質(zhì)與配體形成的N－C、O－C和S－C鍵都很穩(wěn)定，所以配體與基質(zhì)結(jié)合緊密，親和吸附劑使用壽命長，而且便于在親和層析中使用較強(qiáng)烈的洗脫手段，沒有毒性。缺點(diǎn)：用環(huán)氧氯丙烷活化的基質(zhì)在與配體偶聯(lián)時(shí)需要堿性條件，pH為9-13，溫度為20-40℃。這樣的條件對于一些比較敏感的配體可能不適用。另外還有甲苯磺酰氯法、雙功能試劑法等。

223、偶聯(lián)經(jīng)過活化和洗滌過的基質(zhì)與等體積的0.2-0.5mol/L碳酸鹽緩沖液混合，緩慢攪拌2小時(shí)，或室溫下過夜，以便配體和基質(zhì)充分偶聯(lián)而形成固體載體。對于偶聯(lián)極牢固會(huì)喪失活性的大分子物質(zhì)配體，則應(yīng)在低pH值緩沖液中反應(yīng)或活化基質(zhì)預(yù)先在pH8.3的堿性溶液中進(jìn)行適當(dāng)?shù)乃庾饔?，這樣可提高配體的活性。配體和基質(zhì)偶聯(lián)完畢后，必須要反復(fù)洗滌，以去除未偶聯(lián)的配體。另外要用適當(dāng)?shù)姆椒ǚ忾]基質(zhì)中未偶聯(lián)上配體的活性基團(tuán)，也就是使基質(zhì)失活，以免影響后面的親和層析分離。例如對于能結(jié)合氨基的活性基團(tuán)，常用的方法是用2－乙醇胺、氨基乙烷等小分子處理。

234、配體結(jié)合量的測定配體結(jié)合量一般是用每毫升或每克貯存膠束縛配體的量來表示，測得的配體結(jié)合量，可作為決定親和吸附劑實(shí)際用量的參數(shù)，具體測定方法有直接測定法（2,4,6-三硝基苯磺酸鈉的顏色試驗(yàn)和根據(jù)配體的特征來進(jìn)行測定）和間接測定法（推算法和根據(jù)親和吸附劑對被吸附物質(zhì)的操作容量可計(jì)算配體的結(jié)合量）。

245、洗脫當(dāng)親和作用很大，用通常的方法不能洗脫目標(biāo)產(chǎn)物時(shí)，可用尿素或鹽酸胍等變性劑溶液使目標(biāo)產(chǎn)物變性，失去與配基的結(jié)合能力。但應(yīng)注意目標(biāo)產(chǎn)物變性后能否復(fù)性。洗脫結(jié)束后，親和柱仍需繼續(xù)用洗脫劑洗滌，直到無親和物存在為止，再用平衡緩沖液充分平衡親和柱，以備下次使用。圖8.2親和層析操作示意圖

25親和層析的應(yīng)用親和層析的基本原理操作步驟目錄制備方法

26親和層析能有效地保持生物活性物質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，其回收率也非常高，對含量極少又不穩(wěn)定的生物活性藥物的分離極為有效，它是一種專門用于分離純化生物大分子的層析分離技術(shù)。相應(yīng)的配體所要分離的目的產(chǎn)物底物、抑制劑、輔酶（輔因子）抗體凝集素激素輔酶和磷酸酰苷過渡金屬離子（Cu2+等）組氨酸肝素酶抗原、病毒、細(xì)胞多糖、糖蛋白、細(xì)胞受體受體、載體蛋白脫氫酶和激酶蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)脂蛋白、脂肪酶、甾體受體、限制性核酸內(nèi)切酶、抗凝血酶、凝血蛋白質(zhì)等

27抗體利用抗體為配基的親和層析又稱為免疫親和層析（Immunoaffinitychromatography）。抗體與抗原之間具有高度特異性結(jié)合能力，結(jié)合常數(shù)一般為107～1012L/mol。因此，利用免疫親和層析法，特別是以單抗為配基的免疫親和層析法是高度純化蛋白質(zhì)類生物大分子的有效手段。凝集素凝集素（lectin）是與糖特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)（酶和抗體除外）的總稱，大部分凝集素為多聚體，含有兩個(gè)以上的糖結(jié)合部位，不同的凝集素與糖結(jié)合的特異性不同。例如，常用做親和配基的伴刀豆球蛋白A(concanavalinA，conA)與葡聚糖和甘露糖的親和結(jié)合作用較強(qiáng)。

28輔酶和磷酸酰苷各種脫氫酶和激酶需要在輔酶（coenzyme）的存在下表現(xiàn)其生物催化活性，即脫氫酶和激酶與輔酶之間具有親和作用。輔酶主要有輔酶Ⅰ（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，nicotinamideadeninedinucleotide，NAD）、輔酶Ⅱ（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADphosophate，NADP）和三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）等。這些輔酶可用做脫氫酶和激酶的親和配基。此外，磷酸腺苷（adenosine5’-monophosphate，AMP）、二磷酸腺苷（adenosine2’，5’-diphosphate，ADP）的腺苷部分與上述輔酶的結(jié)構(gòu)類似，與脫氫酶和激酶同樣具有親和結(jié)合作用，可用做這些酶的親和配基。過渡金屬離子Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+等過渡金屬離子可與N、S和O等供電原子（electrondonoratom）產(chǎn)生配位鍵，因此可與蛋白質(zhì)表面的組氨酸（His）的咪唑基、半胱氨酸（Cys）的巰基和色氨酸（Trp）的吲哚基發(fā)生親和結(jié)合作用，其中以His的咪唑基的結(jié)合作用最強(qiáng)。過渡金屬離子與咪唑基的結(jié)合強(qiáng)弱順序是Cu2+＞Ni2+＞Zn2+≥Co2+。

29組氨酸組氨酸的性質(zhì)比較獨(dú)特：具有弱疏水性、咪唑環(huán)為弱電性。因此組氨酸可與蛋白質(zhì)發(fā)生親和結(jié)合作用。這種親和作用的機(jī)理尚不十分清楚。在鹽濃度較低和pH約等于目標(biāo)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的溶液中，固定化組氨酸的親和吸附作用最強(qiáng)，隨著鹽濃度增大，親和吸附作用降低。因此利用組氨酸為配基可親和分離等電點(diǎn)相差較大的蛋白質(zhì)，洗脫則可采用增大鹽濃度的梯度洗脫法。肝素肝素（heparin）是存在于哺乳動(dòng)物的肝、肺、腸等臟器中的酸性多糖類物質(zhì)，分子量一般為5～30KD，具有抗凝血作用。肝素與脂蛋白、脂肪酶、甾體受體、限制性核酸內(nèi)切酶、抗凝血酶、凝血蛋白質(zhì)等具有親和作用，可用作這些物質(zhì)的親和配基。肝素的親和結(jié)合作用在中性pH和低濃度鹽溶液中較強(qiáng)，隨著鹽濃度的增大結(jié)合作用降低。

30親和層析的應(yīng)用親和層析最初用于蛋白質(zhì)特別是酶的分離和精制上，后來發(fā)展到大規(guī)模應(yīng)用于酶抑制劑、抗體和干擾素等的分離精制上。目前，親和層析已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物分子的分離和純化，如結(jié)合蛋白、酶、抑制劑、抗原、抗體、激素、激素受體、糖蛋白、核酸及多酶類等；也可以用于分離細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒等。