生物制品-第三章生物制品幻燈片

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第三章滅活劑、保護(hù)劑、與免疫增強(qiáng)劑第一節(jié)滅活劑一、滅活與滅活劑

1（一）滅活：殺死病原微生物，但不影響免疫原性；其次是破壞血清的補(bǔ)體，以免干擾血清學(xué)反應(yīng)結(jié)果。滅活劑：滅活微生物的化學(xué)試劑。滅活方法：物理滅活：加熱、超聲波及射線滅活微生物，此方法免疫原性易破壞，現(xiàn)很少使用（血清56°C半小時滅活補(bǔ)體用此方法）?；瘜W(xué)滅活：用化學(xué)試劑將病原微生物殺死，此方法經(jīng)常使用。

2二、常用的滅活劑種類和原理（一）甲醛：是最古老常用的滅活劑，現(xiàn)在我國用的26種滅活疫苗，均以甲醛為滅活劑。性質(zhì)：甲醛為刺鼻的氣體，水溶液叫福爾馬林，濃度為36%-40%。10°C以下易聚合成三聚甲醛或多聚甲醛，為白色沉淀。

3原理：甲醛的醛基起滅活作用，可使蛋白質(zhì)的氨基→羥甲基胺羧基→亞甲基二醇單酯羥基→羥甲基酚巰基→硫代亞甲基二醇

4濃度：需氧菌甲醛濃度到0、1%--0、2%.厭氧菌0、4%--0、8%.病毒0、05%--0、4%.原則是濃度低，時間短，溫度低可以滅活細(xì)菌，盡量減少破壞抗原（通常加入量，以甲醛含量量計算，折合福爾馬林濃度）。

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6（二）烷化劑：將烷基引入，形成烷基取代物，使微生物變性死亡。原理：主要破壞病毒的核酸，作用于A：G堿基，引起DNA單鏈斷裂或雙鏈鉸連。此類常用于病毒滅活，種類有AEI—N-乙酰乙烯亞胺，加入濃度到0、05%。BEI—二乙烯亞胺，濃度0、02%；EEI—2—乙基乙烯亞胺，GDA—縮水甘油醛。滅活后加硫代硫酸鈉可終止滅活，防止抗原損失。保存：AEI，0--4°C一年，--20°C二年；BEI0--4°C保存一個月。

7（三）苯酚（石碳酸）人類用的第一個消毒藥，具有特殊氣味的無色結(jié)晶，易潮解成水溶液，與光、氧后顏色變紫色。原理：蛋白質(zhì)變性以及抑制氧化脫氫酶，芽孢和病毒對它抵抗力強(qiáng)。滅活濃度：抑菌作用是0、2—0、5%（血清防腐），殺菌是1%，殺葡萄球菌是3%。消毒常用它的衍生物，來蘇兒（甲酚皂）3—5%濃度，特殊氣味，覆蓋其他氣味，也是醫(yī)院常用的。

8(JosephLister,1827~1912)首創(chuàng)用石炭酸噴灑手術(shù)室和煮沸手術(shù)用具以防術(shù)后感染，為防腐、消毒，以及無菌操作奠定了基礎(chǔ)。

9（四）結(jié)晶紫（龍膽紫），也叫紫藥水，堿性染料，也叫甲紫或甲基青蓮，化學(xué)名，六甲基副玫瑰苯胺。原理：堿性陽離子可結(jié)合細(xì)菌陰離子羧基；干擾細(xì)胞壁粘肽合成；常作用于革蘭氏陽性菌。生物制品的應(yīng)用有豬瘟結(jié)晶紫疫苗，雞白痢染色抗原。

10（五）β—丙酰內(nèi)酯良好病毒滅活劑，性狀是無色有氣味液體，易潮解和高溫失效，5°C密封保存好，現(xiàn)主要用于狂犬滅活苗。另還有防治細(xì)菌霉菌生長的防腐劑：硫柳汞（乙基汞硫代水楊酸鈉），疊氮鈉（NaN3）它們使用濃度0、01-0、02%?？煞乐寡甯瘮　?/p>

11三、影響滅活作用的因素（一）藥物的特異性：酚類不能殺滅真菌和病毒，陽離子的結(jié)晶紫，主要作用于G+菌。（二）微生物的種類和特異性：G+菌和G-菌對藥物敏感不一樣，繁殖體和芽孢對藥物敏感也不一樣。（三）藥物濃度：濃度愈大，滅活越快，抗原也損失大；但是，95%酒精沒75%酒精殺滅細(xì)菌好。

12（四）溫度：溫度與滅活成正比，每升高10度，金屬類殺菌作用增加2—5倍。但高溫超過40°C，抗原也損失大。（五）時間：滅活時間與溫度和濃度成反比，即滅活殺菌長，溫度舊低，濃度也低，就可以殺滅細(xì)菌。（六）pH：堿性快，酸性慢，酸性環(huán)境對抗原保護(hù)好。（七）有機(jī)物存在：環(huán)境的有機(jī)物減低滅活的效果，微生物也是有機(jī)物。

13四、滅活疫苗時的注意事項2人參加滅活，注意藥品名和量，滅活后標(biāo)記。37°C滅活一天后，接種適宜培養(yǎng)基—無菌檢查。動物試驗，滅活苗制成后，注射小白鼠0、2ml，兩只，觀察3天。使用試驗：用戶可先注射1-2頭，觀察1—2天，看有無過敏，應(yīng)激等反應(yīng)，證明安全，才全群使用。

14思考題：什么叫滅活和滅火劑？滅活劑的種類有哪些？影響滅活的因素是什么？滅活的注意事項有哪些？

15第二節(jié)保護(hù)劑保護(hù)劑也叫穩(wěn)定劑，是防止微生物在凍干過程中受到破壞。按作用原理分兩類：滲透劑：能滲入細(xì)胞，使胞內(nèi)外滲透壓平衡，防止慢凍時損傷細(xì)胞。有甘油，蔗糖，二甲基亞砜。非滲透劑：防止細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換在速凍時保護(hù)細(xì)胞。有蛋白質(zhì)，聚乙烯吡咯酮。

16按保護(hù)劑分子量分類：低分子量保護(hù)劑：糖、氨基酸類。高分子量保護(hù)劑：脫脂牛奶、明膠。

17按化學(xué)性質(zhì)分類：復(fù)合物：脫脂牛奶，血清。糖類：蔗糖、乳糖。鹽類：乳酸鈣、谷氨酸鈉。醇類：甘油，山梨醇，甘露醇。酸類：檸檬酸，氨基酸。聚合物：葡聚糖，聚乙烯吡咯酮。

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19一、凍干保護(hù)劑的組成和作用按組成將保護(hù)劑分為營養(yǎng)液，賦形劑，抗氧化劑。營養(yǎng)液：使受損細(xì)胞修復(fù)：脫脂牛奶，蛋白質(zhì)，氨基酸，糖類。賦形劑：骨架作用，制品形成網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，易溶解----蔗糖，乳糖。抗氧化劑：保護(hù)酶類，防止氧化—VC，VE，硫代硫酸鈉。

20保護(hù)劑的作用：防止細(xì)胞內(nèi)水結(jié)晶和細(xì)胞失去水分。平衡細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，防止細(xì)胞破裂。助于細(xì)胞修復(fù)以及凍干后復(fù)蘇。

21二、影響保護(hù)劑效果的因素判斷保護(hù)劑的好壞，從凍干后的存活率，以及生物制品的保質(zhì)期研究。然后對不同物質(zhì)篩選不同配方，選出好的保護(hù)劑。1、保護(hù)劑的種類：不同微生物用不同的保護(hù)劑。2、保護(hù)劑的濃度：5—10%的葡萄糖保存大腸桿菌存活率高。3、保護(hù)劑配制方法：糖、血清、維生素不能高溫滅菌，糖可以114°C30分鐘滅菌，其他可以過濾除菌。4、保護(hù)劑的pH：一般為6-8。

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23三、常用的保護(hù)劑生物制品保護(hù)劑很多，各國家不同，如雞新城疫苗（ND），我國是5%蔗糖脫脂牛奶；日本是5%乳糖、0、15%聚乙烯吡咯酮、1%馬血清。

24(一)不同微生物用不同保護(hù)劑細(xì)菌疫苗：10%蔗糖；5%蔗糖脫脂牛奶；5%蔗糖、1、5%明膠；10-20%脫脂牛奶。厭氧菌苗：0、1%谷氨酸鈉、10%乳糖；10%脫脂牛奶；7、5%葡萄糖血清。病毒疫苗：多用混合保護(hù)劑，如5%蔗糖脫脂牛奶。

25(二)幾種常用的保護(hù)劑5%蔗糖脫脂牛奶—新城疫疫苗明膠蔗糖保護(hù)劑---禽霍亂疫苗聚乙烯吡咯酮乳糖—厭氧菌SPGA（蔗糖76、62g，磷酸二氫鉀0、52g，磷酸氫二鉀1、62g，谷氨酸鈉0、83g，牛血清蛋白10g，去離子水1000ml）雞馬立克氏疫苗。

26(三)保護(hù)劑的添加：一般是疫苗和保護(hù)劑1：1加入（5%蔗糖脫脂牛奶—新城疫疫苗），還有是按疫苗量加入保護(hù)劑到規(guī)定濃度（如5%蔗糖明膠保護(hù)劑，加疫苗是先配濃度高的40%的蔗糖、12%明膠，然后按疫苗7份，保護(hù)劑1份混合。）。弱毒疫苗飲水：加0、2%奶粉，以中和水中的有害離子和毒性物質(zhì)。

27思考題：什么叫保護(hù)劑？組成和作用是什么？影響保護(hù)劑效果的因素有哪些？常用保護(hù)劑有哪些？

28第三節(jié)免疫佐劑一、佐劑的概念和原理：（一）概念：adjuvant一詞來源于拉丁語，即輔佐之意。免疫佐劑是一種非特異免疫增強(qiáng)劑，先注射或和抗原同時注射，能明顯增強(qiáng)免疫反應(yīng)。最新概念：凡是增強(qiáng)抗原特異性免疫反應(yīng)的物質(zhì)，均叫佐劑。

29（二）佐劑具備的條件1、安全無毒副作用。2、無致癌性。3、純度高，吸附力強(qiáng)，易吸收。4、不含與動物交叉免疫的抗原物質(zhì)。5、不引起機(jī)體對自身超敏性。6、耐儲存，1年以上，不變質(zhì)。

30（三）作用機(jī)理：抗原遞程—助于吞噬細(xì)胞的吞噬和抗原傳遞。引起細(xì)胞浸潤?？乖瓕ふ摇黾涌乖繕?biāo)，改變抗原構(gòu)型，吸引吞噬細(xì)胞；延長體內(nèi)儲存。免疫調(diào)節(jié)—增強(qiáng)免疫應(yīng)答，包括細(xì)胞免疫和體液免疫。

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32佐劑的分類：按物理性質(zhì)：顆粒型佐劑，非顆粒佐劑。按生物學(xué)性質(zhì)：微生物和非微生物佐劑。按存儲時間：儲存型和非存儲型。

33（一）顆粒型佐劑—將抗原包括成顆粒狀。1、鹽類佐劑—氫氧化鋁膠，明礬，磷酸三鈣等。2、油類佐劑A、弗氏佐劑：1935年，美籍匈牙利學(xué)者Freund發(fā)明，分弗氏不完全佐劑：礦物油75-85%+加羊毛脂（乳化劑）15—25%，充分乳化即成，簡寫FIA,Freundsincompleteadvuant；弗氏完全佐劑：是在FIA中加入死結(jié)核桿菌或卡介苗即成，縮寫FCA.。

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35B、礦物油司本佐劑（現(xiàn)在經(jīng)常用的，以后專講）3、免疫刺激復(fù)合物佐劑—簡寫ISCOM佐劑（皂苷類）。4、蜂膠佐劑5、脂質(zhì)體佐劑其它佐劑—MF59，微膠囊佐劑。

36（二）非顆粒佐劑肽類佐劑：胞壁酰二肽（結(jié)核桿菌細(xì)胞壁），脂肽及免疫調(diào)節(jié)多肽。表面活性劑：海藻糖合成的衍生物。核酸類：合成核苷酸聚合體，次黃嘌呤衍生物，免疫刺激序列DNA。

37含硫復(fù)合物：左旋咪唑（既可驅(qū)蟲，又可免疫增強(qiáng)）。高分子碳水化合物，香菇多糖。細(xì)胞因子：IL—1、2、4；干擾素，轉(zhuǎn)移因子等。其它，霍亂毒素，類毒素。

38三、常規(guī)免疫佐劑（一）鹽類佐劑1926年Gleny使用鋁膠佐劑，幾十年來，人畜疫苗已經(jīng)廣泛使用該佐劑。作用機(jī)理：a，儲存和延緩吸收；b、增加抗原表面積；c、形成巨噬細(xì)胞肉芽腫（增強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫）。

391、氫氧化鋁膠合成方法：有三種，鋁粉加燒堿；明礬加碳酸鈉以及明礬加氨水等。明礬加氨水方法：20%澄清的明礬水，溫度60度，邊攪邊加氨水，到pH8時停止，然后打磨均勻，清水漂洗多次硫酸根離子，到pH7時既可，裝瓶高壓滅菌，用時20%加入疫苗。

402、明礬：有鉀明礬和胺明礬，主要是吸附、沉淀、濃縮作用；精致10%明礬水，滅菌，25度保存，按疫苗量1—2%加入，搖勻即可，有沉淀作用。主要用于破傷風(fēng)類毒素的沉淀和氣腫疽滅活疫苗的使用。3、磷酸三鈣佐劑，與鋁膠同樣作用，制作簡便。將滅菌的20%氯化鈣2、5ml加入100ml疫苗中搖勻，再加入20%磷酸氫二鈉7、5ml，搖勻即成白色絮狀沉淀。加的次序不能錯，該佐劑沉淀作用比鋁膠強(qiáng)。

41（二）油類佐劑（礦物油司本佐劑）乳化劑是一種降低其它溶液表面張力作用的物質(zhì)，可使一種物質(zhì)分散混合于另一不相容的液體中。司本80或吐溫80既是乳化劑。他們可使油類和水劑疫苗乳化均勻。疫苗水劑是分散相（內(nèi)相）,油類為連續(xù)相（外相），兩者中間是乳化劑，可以做成油包水，W/O；也可以做成水包油，O/W;前者不易吸收，儲存時間長。后者容易吸收和釋放。

42最常用是白油司本佐劑方法：制備油相：94%杭州10號白油，加6%司本80（HLB，親水親油值，值高親水強(qiáng)，值低親油強(qiáng)），HLB是4、2，混合后加2%硬質(zhì)酸鋁，熬化溶解，高壓滅菌備用。水相：疫苗加4%吐溫80（HLB15）攪拌均勻即成。按油：水，3—1：1進(jìn)行高速攪拌或膠體磨磨3遍就成。如果攪拌油中慢慢加入水相，制成是油包水，W/O，反之是水包油，O/W。

43油乳疫苗檢驗：1、粘度檢測：口徑Ф1、2mm吸管，吸1ml乳劑，放出0、4ml的時間在2—6秒為宜，不可多于10—15秒，注射困難。2、穩(wěn)定性檢查：①加速老化試驗，37度，10—30天，不破乳；②離心3000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘不分層，可以保存一年。

44（三）蜂膠佐劑1、蜂膠的理化特性：蜂膠含樹脂、蜂分泌物，蜂蠟、花粉及其它多種物質(zhì)，為固體粘稠狀，冷硬熱軟，灰褐色，20-40度發(fā)粘，15度下變硬脆，60-70度液化。等級：乙醇溶解后測含量，含66-70%為一級；61-65%為二級；56-60%三級；50-55%是四級。方法：2、5克蜂膠，加乙醇25ml冷浸24h，濾紙過濾，45度干燥，計算浸出物的含量。

452、作用：抗菌抗病毒、抗腫瘤、消炎和免疫增強(qiáng)作用。3、蜂膠的使用①蜂膠處理：溫度4-8度粉碎，過篩，1：4加入乙醇浸泡24-48h，濾紙過濾去渣，算出含量，4度保存。②蜂膠的加入：一般按疫苗量的到10mg/ml，搖勻成乳濁狀。山東濱州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)蜂膠系列疫苗。

46第四節(jié)新型免疫佐劑一、細(xì)胞因子佐劑（一）細(xì)胞因子的概念和分類概念：是細(xì)胞釋放出類似激素作用的生物效應(yīng)物質(zhì)，在免疫應(yīng)答中起重要作用。分類：經(jīng)典細(xì)胞因子：淋巴毒素，腫瘤壞死因子，干擾素。免疫調(diào)節(jié)因子：白細(xì)胞介素，集落刺激因子。

47（二）作用特點：三多一高一快。多效性—非特異免疫調(diào)節(jié)多源性—多種細(xì)胞可以產(chǎn)生一種因子多靶性—作用多個免疫靶細(xì)胞高效性—類似激素，少量就可以，也叫免疫激素快速性—快速反應(yīng)，如速發(fā)變態(tài)反應(yīng)。

48（三）細(xì)胞因子的作用1、提高疫苗免疫效果—IL—2與藍(lán)耳疫苗合用。2、預(yù)防治療傳染病，腫瘤：腫瘤壞死因子，干擾素，轉(zhuǎn)移因子。3、構(gòu)建新基因工程疫苗，細(xì)胞因子插入疫苗，可以增強(qiáng)免疫效果。

49（四）幾種重要的細(xì)胞因子IL-1:淋巴細(xì)胞活化因子，活化多種免疫細(xì)胞IL-2：T細(xì)胞生長因子，也促進(jìn)B細(xì)胞增殖，應(yīng)用多。IL-4：B細(xì)胞刺激因子IL-12：B細(xì)胞產(chǎn)生的，促進(jìn)淋巴細(xì)胞成熟干擾素：抗病毒，抗腫瘤，免疫調(diào)節(jié)。

50二、CPGDNA（胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸）是非甲基化的CPGDNA，也叫免疫刺激序列，作用是激活NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及B細(xì)胞增殖。三、基因工程減毒素通過基因工程技術(shù)，切除毒素有害基因，然后在細(xì)胞中表達(dá)，無毒，還有良好免疫原性。種類：霍亂毒素（CT）：粘膜免疫佐劑，口服免疫。

51大腸桿菌不耐熱腸毒素（LT），也是粘膜免疫佐劑。破傷風(fēng)類毒素（TT）注射疫苗佐劑。

52四、其它免疫佐劑（一）免疫刺激復(fù)合物（iscom）是抗原：皂苷：膽固醇=1：1：1制成，為脂質(zhì)小泡，作用，提高抗原傳遞，可與多種疫苗混合，還可以粘膜免疫。（二）脂質(zhì)體人工合成多層脂質(zhì)小體，包埋抗原，提高抗原傳遞。（三）MF59佐劑4、3%角鯊?fù)?0、5%吐溫80+0、5%司本85組成，多用于病毒疫苗佐劑，可刺激體液免疫也可以細(xì)胞免疫。

53思考題：什么叫佐劑？條件、作用原理是什么？佐劑按物理性質(zhì)，可分為哪些種類？什么叫弗氏不完全佐劑和弗氏完全佐劑？什么叫細(xì)胞因子？有何特點？主要有哪些？常規(guī)佐劑有哪些？新型佐劑有哪些？鋁膠和司本油類佐劑如何配制？