骨肉瘤誘導(dǎo)分化與多藥耐藥表型的生物學(xué)性狀比較.doc

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1、骨肉瘤誘導(dǎo)分化與多藥耐藥表型的生物學(xué)性狀比較作者：曾恒，陳安民，李鋒，方煌，夏仁云【摘要】［目的］探討誘導(dǎo)分化劑誘導(dǎo)骨肉瘤分化時同骨肉瘤耐藥狀態(tài)產(chǎn)生的分化情況的異同點(diǎn)，以便正確認(rèn)識分化與耐藥相關(guān)性。［方法］以誘導(dǎo)分化劑ATRA，IL4處理人成骨肉瘤細(xì)胞系，對比MG63耐藥表型MG63/R，觀察瘤細(xì)胞生物學(xué)性狀。用原位雜交分析在這一轉(zhuǎn)化過程上凋亡調(diào)控基因P53，bcl2mRNA表達(dá)，用Tunel法分析細(xì)胞的凋亡。MTT法檢查細(xì)胞對藥物敏感性。［結(jié)果］MG63/R，以及IL4，ATRA處理的MG63，細(xì)胞均出現(xiàn)分化，ATRA處理的MG63表現(xiàn)多藥耐藥性，并同MG

2、63/R表現(xiàn)出了相似的特性而IL4處理的細(xì)胞分化的同時并未出現(xiàn)耐藥。［結(jié)論］腫瘤細(xì)胞分化的過程中有可能出現(xiàn)一種頑固的多藥耐藥的亞分化狀態(tài)，這種差異性分化的產(chǎn)生可能同細(xì)胞種類、狀態(tài)、藥物作用特點(diǎn)及劑量有關(guān)，如何控制細(xì)胞向耐藥狀態(tài)的分化為腫瘤的治療提出了新的難題?！娟P(guān)鍵詞】骨肉瘤；多藥耐藥；分化；凋亡；P53；bcl2;ATRA;IL4　　傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為骨肉瘤的耐藥表型同骨肉瘤惡性程度成正相關(guān)，現(xiàn)在認(rèn)為骨肉瘤耐藥表型是一種相對分化的狀態(tài)，其增殖能力、侵襲能力及轉(zhuǎn)移能力較藥敏腫瘤細(xì)胞呈明顯下降。MDR/P170是經(jīng)典的耐藥途徑，可使腫瘤細(xì)胞對多種結(jié)構(gòu)和功能不相關(guān)的抗癌藥產(chǎn)生耐藥

3、性。而且可以通過多種彼此結(jié)構(gòu)功能無任何相關(guān)性的藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生翻譯和表達(dá)〔3〕。據(jù)認(rèn)為分化誘導(dǎo)劑在治療惡性腫瘤使其化分的過程中能產(chǎn)生多藥耐藥性。在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性的過程中同時也出現(xiàn)了分化。這兩種分化狀態(tài)的細(xì)胞是否存在著相關(guān)性？　　本實(shí)驗(yàn)利用腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化劑維甲酸和IL4分別誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞化〔8〕。比較觀察維甲酸（ATRA）和IL4分別誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞亞系同骨肉瘤的耐藥表型之間在生物學(xué)上的異同點(diǎn)?！　?實(shí)驗(yàn)材料和方法　　1.1主要試劑和細(xì)胞　　人成骨肉瘤細(xì)胞系MG63（武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)生物館藏中心）及其耐藥表型MG63/R（由MG63經(jīng)ADM間斷沖擊法誘導(dǎo)產(chǎn)

4、生）〔7〕，維甲酸（ATRA）為上海華聯(lián)制藥有限公司產(chǎn)品，人重組IL4購自晶美公司、足葉乙甙（VP16）北京制藥廠、四甲基偶氮唑鹽（MTT）華美生物工程公司、長春新堿（VCR）為上海化聯(lián)制藥有限公司、絲裂霉素C（MML）日本協(xié)和公司、鼠抗人Pgp（C219）單克隆抗體及地高辛標(biāo)記的bcl2、P53的原位雜交試劑盒購自博士德公司。7　　1.2細(xì)胞培養(yǎng)條件　　細(xì)胞在37℃、5%CO2飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%的熱滅活胎牛血清、青霉素100IU/ml和鏈霉素100μg/ml的完全DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基。48h換液，細(xì)胞匯合時，用0.25%的胰蛋白酶/0.02%

5、EDTA（1∶1）消化傳代?！　?.3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化　　MG63（1×104/ml）細(xì)胞培養(yǎng)中分別加入ATRA（10-5mol/L）和IL-4(500U/ml)，連續(xù)培養(yǎng)5d后從形態(tài)學(xué)、生化代謝、瘤細(xì)胞增殖周期動力學(xué)方面評價細(xì)胞的性狀?！　?.4Pgp檢測Westenblot　　取上述藥物處理后的細(xì)胞及MG63/R、MG63，提取細(xì)胞總蛋白制備樣品〔5〕，并配置SDSPAGE凝膠，行SDSPAGE凝膠電泳，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移和膜封閉，封閉結(jié)束后，加入用漂洗液稀釋的抗Pgp抗體（購自晶美生物工程公司）（1∶500）封口，孵育過夜；加入用漂洗稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗

6、（1∶1000）大量TBS漂洗液洗膜3次，各10min避光用BCIP/NBT/Buffer（140ml∶80ml∶10ml）顯色。圖像經(jīng)Uvpgrabitimagel軟件采集，GelwordsIDAdvancedV4.01軟件處理分析?！　?.5細(xì)胞周期及凋亡分析采用流式細(xì)胞PI染色法　　制備單細(xì)胞懸液［（4～7）×106/ml］用70%乙醇固定〔1〕，4℃保存，染色前用PBS進(jìn)行離心沉淀去除固定液，加200μlRNaseA37℃水浴30min，再加入100μlPI染色液混勻，至4℃避光30min，上機(jī)測試，記錄激發(fā)光488nm處紅色熒光。　　1.6堿性磷酸酶活性的測定　　

7、細(xì)胞用胰酶消化后，重懸于10mmol/LTris·HCl（pH7.4）含1mmol/LKCl30mmol/LZnCl2,0.1%TritonX-100，超聲破膜30s，后將處理后用4℃8000g離心后，用Lowry法檢測ALP活性，并雙宿脲法檢測蛋白含量，單位為μmol/min/ngprotein?！　?.7腫瘤細(xì)胞藥物敏感性的測定　　采用MTT生物活性檢測法，所獲結(jié)果用加權(quán)線性回歸法計(jì)算各藥物對腫瘤細(xì)胞的抑制濃度（IC50）?！　?.8P53和bcl2表達(dá)水平檢測7　　采用原位雜交分別檢測P53和b