骨肉瘤誘導分化與多藥耐藥表型的生物學性狀比較.doc

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1、骨肉瘤誘導分化與多藥耐藥表型的生物學性狀比較作者：曾恒，陳安民，李鋒，方煌，夏仁云【摘要】［目的］探討誘導分化劑誘導骨肉瘤分化時同骨肉瘤耐藥狀態(tài)產生的分化情況的異同點，以便正確認識分化與耐藥相關性。［方法］以誘導分化劑ATRA，IL4處理人成骨肉瘤細胞系，對比MG63耐藥表型MG63/R，觀察瘤細胞生物學性狀。用原位雜交分析在這一轉化過程上凋亡調控基因P53，bcl2mRNA表達，用Tunel法分析細胞的凋亡。MTT法檢查細胞對藥物敏感性。［結果］MG63/R，以及IL4，ATRA處理的MG63，細胞均出現分化，ATRA處理的MG63表現多藥耐藥性，并同MG

2、63/R表現出了相似的特性而IL4處理的細胞分化的同時并未出現耐藥。［結論］腫瘤細胞分化的過程中有可能出現一種頑固的多藥耐藥的亞分化狀態(tài)，這種差異性分化的產生可能同細胞種類、狀態(tài)、藥物作用特點及劑量有關，如何控制細胞向耐藥狀態(tài)的分化為腫瘤的治療提出了新的難題。【關鍵詞】骨肉瘤；多藥耐藥；分化；凋亡；P53；bcl2;ATRA;IL4　　傳統(tǒng)觀點認為骨肉瘤的耐藥表型同骨肉瘤惡性程度成正相關，現在認為骨肉瘤耐藥表型是一種相對分化的狀態(tài)，其增殖能力、侵襲能力及轉移能力較藥敏腫瘤細胞呈明顯下降。MDR/P170是經典的耐藥途徑，可使腫瘤細胞對多種結構和功能不相關的抗癌藥產生耐藥

3、性。而且可以通過多種彼此結構功能無任何相關性的藥物誘導產生翻譯和表達〔3〕。據認為分化誘導劑在治療惡性腫瘤使其化分的過程中能產生多藥耐藥性。在誘導腫瘤細胞產生多藥耐藥性的過程中同時也出現了分化。這兩種分化狀態(tài)的細胞是否存在著相關性？　　本實驗利用腫瘤細胞的誘導分化劑維甲酸和IL4分別誘導腫瘤細胞化〔8〕。比較觀察維甲酸（ATRA）和IL4分別誘導的腫瘤細胞亞系同骨肉瘤的耐藥表型之間在生物學上的異同點?！　?實驗材料和方法　　1.1主要試劑和細胞　　人成骨肉瘤細胞系MG63（武漢大學中國典型培養(yǎng)生物館藏中心）及其耐藥表型MG63/R（由MG63經ADM間斷沖擊法誘導產

4、生）〔7〕，維甲酸（ATRA）為上海華聯制藥有限公司產品，人重組IL4購自晶美公司、足葉乙甙（VP16）北京制藥廠、四甲基偶氮唑鹽（MTT）華美生物工程公司、長春新堿（VCR）為上?；撝扑幱邢薰?、絲裂霉素C（MML）日本協和公司、鼠抗人Pgp（C219）單克隆抗體及地高辛標記的bcl2、P53的原位雜交試劑盒購自博士德公司。7　　1.2細胞培養(yǎng)條件　　細胞在37℃、5%CO2飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%的熱滅活胎牛血清、青霉素100IU/ml和鏈霉素100μg/ml的完全DMEM細胞培養(yǎng)基。48h換液，細胞匯合時，用0.25%的胰蛋白酶/0.02%

5、EDTA（1∶1）消化傳代?！　?.3誘導腫瘤細胞分化　　MG63（1×104/ml）細胞培養(yǎng)中分別加入ATRA（10-5mol/L）和IL-4(500U/ml)，連續(xù)培養(yǎng)5d后從形態(tài)學、生化代謝、瘤細胞增殖周期動力學方面評價細胞的性狀?！　?.4Pgp檢測Westenblot　　取上述藥物處理后的細胞及MG63/R、MG63，提取細胞總蛋白制備樣品〔5〕，并配置SDSPAGE凝膠，行SDSPAGE凝膠電泳，將蛋白質電轉移和膜封閉，封閉結束后，加入用漂洗液稀釋的抗Pgp抗體（購自晶美生物工程公司）（1∶500）封口，孵育過夜；加入用漂洗稀釋的堿性磷酸酶標記的二抗

6、（1∶1000）大量TBS漂洗液洗膜3次，各10min避光用BCIP/NBT/Buffer（140ml∶80ml∶10ml）顯色。圖像經Uvpgrabitimagel軟件采集，GelwordsIDAdvancedV4.01軟件處理分析?！　?.5細胞周期及凋亡分析采用流式細胞PI染色法　　制備單細胞懸液［（4～7）×106/ml］用70%乙醇固定〔1〕，4℃保存，染色前用PBS進行離心沉淀去除固定液，加200μlRNaseA37℃水浴30min，再加入100μlPI染色液混勻，至4℃避光30min，上機測試，記錄激發(fā)光488nm處紅色熒光。　　1.6堿性磷酸酶活性的測定　　

7、細胞用胰酶消化后，重懸于10mmol/LTris·HCl（pH7.4）含1mmol/LKCl30mmol/LZnCl2,0.1%TritonX-100，超聲破膜30s，后將處理后用4℃8000g離心后，用Lowry法檢測ALP活性，并雙宿脲法檢測蛋白含量，單位為μmol/min/ngprotein?！　?.7腫瘤細胞藥物敏感性的測定　　采用MTT生物活性檢測法，所獲結果用加權線性回歸法計算各藥物對腫瘤細胞的抑制濃度（IC50）?！　?.8P53和bcl2表達水平檢測7　　采用原位雜交分別檢測P53和b