脂肪干細胞在體外長期傳代后成軟骨成骨能力變化的研究

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1、中山大學碩士學位論文脂肪干細胞在體外長期傳代后成軟骨成骨能力變化的研究姓名：索明環(huán)申請學位級別：碩士專業(yè)：干細胞與組織工程學指導教師：張志光20080530中山大學碩士學位論文脂肪干細胞在體外長期傳代后成軟骨成骨能力的變化研究脂肪干細胞在體外長期傳代后成軟骨成骨能力變化的研究專業(yè)碩士生導師干細胞與組織工程學索明環(huán)張志光教授中文摘要臨床上，組織的損傷非常常見，其修復是個難題。組織工程學的提出給組織修復帶來了曙光。組織工程學至少包括三個因素：種子細胞、支架材料、細胞因子。其中種子細胞是重要的因素之一，它包括胚胎干細胞和成體干細胞。而胚胎干細胞的應用存在很多的倫

2、理問題，成體干細胞就成為組織工程種子細胞的重要來源。脂肪干細胞是來自脂肪組織問充質(zhì)的一種成體干細胞，在體外可長期傳代，自我更新，并可以向多胚層分化。并且脂肪組織含量豐富，分布廣泛，取材容易，脂肪干細胞容易分離獲取，近年來它成為研究的熱點，有望成為組織工程良好的種子細胞。成體干細胞在體外長期傳代會逐漸失去它的表型，細胞特性發(fā)生變化。脂肪問質(zhì)干細胞在體外長期傳代后同樣存在著這個問題。但是細胞要經(jīng)過體外的傳代培養(yǎng)才能達到足夠的細胞量。故脂肪干細胞在體外長期傳代后生物學特性的變化值得研究。軟骨損傷可導致疾病，給病人造成很大的痛苦。而軟骨很難自我再生和重建，因其沒有

3、血供，并缺乏具有自我修復能力的細胞。軟骨組織工程的提出為軟骨的修復帶來了曙光。在一定的條件下誘導脂肪干細胞誘導成軟骨已經(jīng)成為事一I一中山大學碩士學位論文脂肪干細胞在體外長期傳代后成軟骨成骨能力的變化研究實。經(jīng)過體外長期傳代后脂肪干細胞成軟骨性能的變化成為研究的必要。骨組織可以自我修復，但是也存在難于愈合的骨損傷性疾病，Ll-,女n長骨的大面積缺損，粉碎性骨折。這就嚴重影響了病人的行為和生活質(zhì)量。人們希望組織工程骨能夠替代或者幫助修復這種類型的骨組織損傷。脂肪干細胞在體外可以誘導成骨，有很多實驗已經(jīng)證實。但是經(jīng)過長期傳代的脂肪干細胞成骨性能的變化是研究上的一

4、個空白。小型豬的解剖結(jié)構(gòu)和人非常相似，有望成為組織工程器官移植的良好實驗動物。所以本實驗采用中國實驗用I系小型豬做為脂肪干細胞的來源。本研究從三個方面探討長期傳代后的中國實驗用I系小型豬的脂肪干細胞：原代細胞的分離獲取，傳代后形態(tài)，倍增時間，克隆形成率的變化；傳代后成軟骨能力的變化；傳代后成骨能力的變化。第一部分脂肪干細胞的分離、培養(yǎng)、純化及在體外長期傳代后倍增時間和克隆形成率的變化1．1目的體外分離培養(yǎng)中國實驗用I系小型豬的脂肪干細胞，在體外長期傳代后，取第5，10，15代細胞，分析其細胞倍增時間和克隆形成能力的差異。1．2方法1．2．1脂肪組織的獲取和

5、分離培養(yǎng)原代細胞麻醉小型豬，在無菌條件下取少量小豬頸部的脂肪組織(約2-39)，放于PBS中。清洗，剪碎(約lmm3)，盡量去除血管和血細胞。在37*(2下，用0．075％的中山大學碩士學位論文脂肪干細胞在體外長期傳代后成軟骨成骨能力的變化研究I型膠原酶消化組織30～50min，離心后棄去上層組織殘留物和液體，用10％FBS的DMEM液重懸，吸入T-25培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)3天后，用PBS清洗細胞，除去未貼壁細胞，加入新鮮普通培養(yǎng)液。在顯微鏡下觀察原代細胞(即P0)的生長狀況和形態(tài)。1．2．2細胞的傳代、凍存、復蘇在原代細胞長到克隆融合時用O．25％胰酶／0．0

6、2％EDTA消化。將細胞分為兩份，一份繼續(xù)傳代，一份凍存。凍存時的細胞密度為107／m1。復蘇用快速融化法。1．2．3描繪細胞的生長曲線，求出倍增時間同時復蘇P5，10，15代細胞，貼壁培養(yǎng)傳代一次后消化計數(shù)，以每孔5×104個細胞數(shù)接種與24孔板中，共接種14孔。每24h數(shù)兩孔的細胞數(shù)，每孔計數(shù)兩次。共計7天。描繪生長曲線，求出倍增時間。1．2．4細胞的克隆形成率將細胞稀釋至lO個／ml培養(yǎng)液，共10ml。將培養(yǎng)液滴于96孔板中，20min后計算每孔的單個細胞數(shù)。七天后在顯微鏡下計算細胞數(shù)大于50的克隆數(shù)，求出克隆形成率。1．3結(jié)果1．3．1原代和傳代后

7、的細胞形態(tài)和生長狀況三天換液后可見長梭型，短梭型，不規(guī)則型的單個貼壁細胞。4~5天后逐漸形成克隆，7～lO天克隆融合。此時細胞大部分呈不規(guī)則型，折光性差。隨著傳代次數(shù)的增加，細胞形態(tài)大部分呈長梭型，渦旋狀生長，至15代形態(tài)幾乎中山大學碩士學位論文脂肪干細胞在體外長期傳代后成軟骨成骨能力的變化研究沒有變化。1．3．2細胞倍增時間不同細胞株之間存在很大的差異。P5的倍增時間可在40～50h之間，PIO的細胞倍增時問在25～40h之間，而P15倍增時間在35～60h之間波動?？傮w來講同一細胞株內(nèi)細胞倍增時問隨著傳代次數(shù)的增加先變短后又增加。1．3．3克隆形成率不

8、同細胞株之間存在很大的差異。P5的克隆形成率在30---45％之間