脂肪干細(xì)胞在體外長(zhǎng)期傳代后成軟骨成骨能力變化的研究

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1、中山大學(xué)碩士學(xué)位論文脂肪干細(xì)胞在體外長(zhǎng)期傳代后成軟骨成骨能力變化的研究姓名：索明環(huán)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：干細(xì)胞與組織工程學(xué)指導(dǎo)教師：張志光20080530中山大學(xué)碩士學(xué)位論文脂肪干細(xì)胞在體外長(zhǎng)期傳代后成軟骨成骨能力的變化研究脂肪干細(xì)胞在體外長(zhǎng)期傳代后成軟骨成骨能力變化的研究專業(yè)碩士生導(dǎo)師干細(xì)胞與組織工程學(xué)索明環(huán)張志光教授中文摘要臨床上，組織的損傷非常常見，其修復(fù)是個(gè)難題。組織工程學(xué)的提出給組織修復(fù)帶來了曙光。組織工程學(xué)至少包括三個(gè)因素：種子細(xì)胞、支架材料、細(xì)胞因子。其中種子細(xì)胞是重要的因素之一，它包括胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。而胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用存在很多的倫

2、理問題，成體干細(xì)胞就成為組織工程種子細(xì)胞的重要來源。脂肪干細(xì)胞是來自脂肪組織問充質(zhì)的一種成體干細(xì)胞，在體外可長(zhǎng)期傳代，自我更新，并可以向多胚層分化。并且脂肪組織含量豐富，分布廣泛，取材容易，脂肪干細(xì)胞容易分離獲取，近年來它成為研究的熱點(diǎn)，有望成為組織工程良好的種子細(xì)胞。成體干細(xì)胞在體外長(zhǎng)期傳代會(huì)逐漸失去它的表型，細(xì)胞特性發(fā)生變化。脂肪問質(zhì)干細(xì)胞在體外長(zhǎng)期傳代后同樣存在著這個(gè)問題。但是細(xì)胞要經(jīng)過體外的傳代培養(yǎng)才能達(dá)到足夠的細(xì)胞量。故脂肪干細(xì)胞在體外長(zhǎng)期傳代后生物學(xué)特性的變化值得研究。軟骨損傷可導(dǎo)致疾病，給病人造成很大的痛苦。而軟骨很難自我再生和重建，因其沒有

3、血供，并缺乏具有自我修復(fù)能力的細(xì)胞。軟骨組織工程的提出為軟骨的修復(fù)帶來了曙光。在一定的條件下誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)成軟骨已經(jīng)成為事一I一中山大學(xué)碩士學(xué)位論文脂肪干細(xì)胞在體外長(zhǎng)期傳代后成軟骨成骨能力的變化研究實(shí)。經(jīng)過體外長(zhǎng)期傳代后脂肪干細(xì)胞成軟骨性能的變化成為研究的必要。骨組織可以自我修復(fù)，但是也存在難于愈合的骨損傷性疾病，Ll-,女n長(zhǎng)骨的大面積缺損，粉碎性骨折。這就嚴(yán)重影響了病人的行為和生活質(zhì)量。人們希望組織工程骨能夠替代或者幫助修復(fù)這種類型的骨組織損傷。脂肪干細(xì)胞在體外可以誘導(dǎo)成骨，有很多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)。但是經(jīng)過長(zhǎng)期傳代的脂肪干細(xì)胞成骨性能的變化是研究上的一

4、個(gè)空白。小型豬的解剖結(jié)構(gòu)和人非常相似，有望成為組織工程器官移植的良好實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。所以本實(shí)驗(yàn)采用中國實(shí)驗(yàn)用I系小型豬做為脂肪干細(xì)胞的來源。本研究從三個(gè)方面探討長(zhǎng)期傳代后的中國實(shí)驗(yàn)用I系小型豬的脂肪干細(xì)胞：原代細(xì)胞的分離獲取，傳代后形態(tài)，倍增時(shí)間，克隆形成率的變化；傳代后成軟骨能力的變化；傳代后成骨能力的變化。第一部分脂肪干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、純化及在體外長(zhǎng)期傳代后倍增時(shí)間和克隆形成率的變化1．1目的體外分離培養(yǎng)中國實(shí)驗(yàn)用I系小型豬的脂肪干細(xì)胞，在體外長(zhǎng)期傳代后，取第5，10，15代細(xì)胞，分析其細(xì)胞倍增時(shí)間和克隆形成能力的差異。1．2方法1．2．1脂肪組織的獲取和

5、分離培養(yǎng)原代細(xì)胞麻醉小型豬，在無菌條件下取少量小豬頸部的脂肪組織(約2-39)，放于PBS中。清洗，剪碎(約lmm3)，盡量去除血管和血細(xì)胞。在37*(2下，用0．075％的中山大學(xué)碩士學(xué)位論文脂肪干細(xì)胞在體外長(zhǎng)期傳代后成軟骨成骨能力的變化研究I型膠原酶消化組織30～50min，離心后棄去上層組織殘留物和液體，用10％FBS的DMEM液重懸，吸入T-25培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)3天后，用PBS清洗細(xì)胞，除去未貼壁細(xì)胞，加入新鮮普通培養(yǎng)液。在顯微鏡下觀察原代細(xì)胞(即P0)的生長(zhǎng)狀況和形態(tài)。1．2．2細(xì)胞的傳代、凍存、復(fù)蘇在原代細(xì)胞長(zhǎng)到克隆融合時(shí)用O．25％胰酶／0．0

6、2％EDTA消化。將細(xì)胞分為兩份，一份繼續(xù)傳代，一份凍存。凍存時(shí)的細(xì)胞密度為107／m1。復(fù)蘇用快速融化法。1．2．3描繪細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，求出倍增時(shí)間同時(shí)復(fù)蘇P5，10，15代細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)傳代一次后消化計(jì)數(shù)，以每孔5×104個(gè)細(xì)胞數(shù)接種與24孔板中，共接種14孔。每24h數(shù)兩孔的細(xì)胞數(shù)，每孔計(jì)數(shù)兩次。共計(jì)7天。描繪生長(zhǎng)曲線，求出倍增時(shí)間。1．2．4細(xì)胞的克隆形成率將細(xì)胞稀釋至lO個(gè)／ml培養(yǎng)液，共10ml。將培養(yǎng)液滴于96孔板中，20min后計(jì)算每孔的單個(gè)細(xì)胞數(shù)。七天后在顯微鏡下計(jì)算細(xì)胞數(shù)大于50的克隆數(shù)，求出克隆形成率。1．3結(jié)果1．3．1原代和傳代后

7、的細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀況三天換液后可見長(zhǎng)梭型，短梭型，不規(guī)則型的單個(gè)貼壁細(xì)胞。4~5天后逐漸形成克隆，7～lO天克隆融合。此時(shí)細(xì)胞大部分呈不規(guī)則型，折光性差。隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞形態(tài)大部分呈長(zhǎng)梭型，渦旋狀生長(zhǎng)，至15代形態(tài)幾乎中山大學(xué)碩士學(xué)位論文脂肪干細(xì)胞在體外長(zhǎng)期傳代后成軟骨成骨能力的變化研究沒有變化。1．3．2細(xì)胞倍增時(shí)間不同細(xì)胞株之間存在很大的差異。P5的倍增時(shí)間可在40～50h之間，PIO的細(xì)胞倍增時(shí)問在25～40h之間，而P15倍增時(shí)間在35～60h之間波動(dòng)?？傮w來講同一細(xì)胞株內(nèi)細(xì)胞倍增時(shí)問隨著傳代次數(shù)的增加先變短后又增加。1．3．3克隆形成率不

8、同細(xì)胞株之間存在很大的差異。P5的克隆形成率在30---45％之間