smart技術構(gòu)建紅曲霉全長cdna文庫論文

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1、SMART技術構(gòu)建紅曲霉全長cDNA文庫論文.freelechanismat5′endofRNAtranscript)技術構(gòu)建紅曲霉全長cDNA文庫，經(jīng)涂平板和酶切反應測定文庫的克隆數(shù)、重組率，PCR測定插入片斷的大小。結(jié)果原始文庫的庫容為2.03×105，重組率達94%。插入片段大小多在0.7～2.0kb.freeletabolitesinMonascus.MethodsAcDNAlibrary.Thenumberoftheclonesandtherebinationrateofthelibraryinedbyplatecoatingandrestrictivedigestion,and

2、thesizeofinsertedfragmentinedbyPCR.ResultsTheprimarylibrarycapacityentsizeettherequirementforcloningtargetgenesandexpressingtargetproteins.Keyin，培養(yǎng)5d至產(chǎn)生紅曲色素。將菌液離心，沉淀分別用蒸餾水、無菌水、DEPC水潤洗，干燥，稱干重，將樣品放于研缽中，加入液氮，研磨至粉狀。在樣品未融化前加入Trizolreagent，繼續(xù)研磨使樣品溶解。離心，取上清。加氯仿，搖勻，離心，取上清。加異丙醇沉淀RNA。75%(φ)乙醇洗滌沉淀，風干RNA，用無RN

3、ase水溶解沉淀，-70℃保存。得總RNA。使用紫外分析儀檢測總RNA濃度、純度，1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。1.2.2雙鏈cDNA的合成廣東藥學院學報第25卷第3期朱碧云，等.SMART技術構(gòu)建紅曲霉全長cDNA文庫在5μL反應體系中加入1.0μgtotalRNA、SMARTⅣOligonucleotide(5′AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG3′)1μL、CDSⅢ/3′PCR引物5′ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGd(T)30N-1N3′(N=A、G、CorT;N-1=A、GorC1μL，用無RNas

4、e水補足到5μL?；靹颍虝弘x心，72℃，2min;冰上冷卻2min，短暫離心;向反應液中加入5×第一鏈反應緩沖液2.0μL及20mmol/LDTT、10mmol/LdNTP混合液、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶各1μL于42℃孵育60min，置于冰浴中終止反應。取2μL第一鏈產(chǎn)物于干凈預冷0.2mL反應管中，進行PCR擴增。引物為5′PCR引物(5′AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT3′)、CDSⅢ/3′PCR引物。循環(huán)條件為：首先把PCR儀預熱到95℃，再20個循環(huán)：95℃15s，68℃6min。1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并估算其濃度。1.2.3cDNA的分級分離純化及文

5、庫構(gòu)建合成的雙鏈cDNA經(jīng)蛋白酶K消化及SfiⅠ酶切后，柱層析分級，共收集15管，每管取3μL進行1.1%瓊脂糖電泳檢測，合并能顯示亮帶的前4管(片段0.4kb)，進行沉淀，重懸在去離子水中，加T4DNA連接酶，與質(zhì)粒載體pDNRLIB(經(jīng)SfiⅠ酶處理過)于16℃下連接過夜。cDNA與載體的比例為1.5∶1。連接產(chǎn)物經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。電擊條件：電擊杯內(nèi)徑0.1cm，電容25μF，電阻200Ω，電壓1.8kV，感受態(tài)25μL,電轉(zhuǎn)儀：BIORADGenePulserXcell電穿孔儀。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到加有1mLLB培養(yǎng)基的試管中，225r/min，37℃，培養(yǎng)1h。

6、1.2.4原始文庫質(zhì)量鑒定取適量原始文庫菌液，均勻地涂在含30μg/mL氯霉素的LB平板上，隨機挑取15個克隆，提取質(zhì)粒經(jīng)SfiⅠ酶切后電泳檢測，可測定其重組率及重組片段的大小。文庫的擴增采用涂平板培養(yǎng)擴增。取適量原始文庫均勻地涂在10個含30μg/mL氯霉素的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜，用含有25%(φ)甘油LB培養(yǎng)基洗脫所有的菌落，2mL/板，將每板的洗脫液混合搖勻即得到了擴增文庫，檢測其滴度，分裝，放置-80℃保存。2結(jié)果分析2.1總RNA提取提取的樣品總RNA經(jīng)紫外分光光度計測定，A260/A280值為1.77，表明所得總RNA純度較高，但稍有降解。1.1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示

7、(圖1)，28SrRNA、18SrRNA和5.8SrRNA三條特征條帶清晰，表明總RNA比較完整，也沒有明顯的基因組DNA污染。2.2雙鏈cDNA的合成及分級合成的雙鏈cDNA產(chǎn)物的1.1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，成一彌散帶，最大片段超過10kb，主要集中在0.5～2.5kb(圖2)，表明合成的cDNA是比較完整的。由于較小的非全長cDNA片斷更容易連接進載體，所以需要對經(jīng)過蛋白酶K處理和SfiⅠ酶切后的cDNA進行分級