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1、學(xué)校代碼：10264研究生學(xué)號：M100101037上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文題目：大菱鲆微衛(wèi)星標記的開發(fā)與其應(yīng)用Isolationandapplicationof英文題目：microsatellitemarkersforTurbot(ScophthalmusmaximusL.)專業(yè)：水產(chǎn)養(yǎng)殖研究方向：海水魚類遺傳改良研究姓名：李猛指導(dǎo)教師：馬愛軍研究員二0一三年四月十日大菱鲆微衛(wèi)星標記的開發(fā)與其應(yīng)用學(xué)位論文完成日期：指導(dǎo)教師簽字：答辯委員會成員簽字：上海海洋大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：我恪守學(xué)術(shù)道
2、德，崇尚嚴謹學(xué)風。所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨立進行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)明確注明和引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品及成果的內(nèi)容。論文為本人親自撰寫，我對所寫的內(nèi)容負責，并完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔。學(xué)位論文作者簽名：日期：年月日上海海洋大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱或借閱。本人授權(quán)上海海洋大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部
3、或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。保密□，在年解密后適用本版權(quán)書。本學(xué)位論文屬于不保密□學(xué)位論文作者簽名：指導(dǎo)教師簽名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文大菱鲆微衛(wèi)星標記的開發(fā)與其應(yīng)用摘要1.利用FIASCO（FastIsolationbyAFLPofSequencesContainingrepeats）法篩選大菱鲆微衛(wèi)星DNA序列。先用MseI酶酶切大菱鲆的基因組DNA，加接頭，用M00通用引物PCR擴增，建立小片段基因組文庫；再采用
4、以生物素標記的(CA)12，(AC)17，(AG)17，(AT)17，(AAT)10，(AAC)10，(GACA)10，(GATA)10為寡核苷酸探針，與串聯(lián)重復(fù)序列雜交，構(gòu)建大菱鲆的微衛(wèi)星DNA富集文庫；與載體連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞中，經(jīng)含氨芐的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，初篩出2027個陽性菌落；經(jīng)三組PCR反應(yīng)，二次篩選出655個克隆，富集效率為32.3%。測序后得到597條序列，經(jīng)分析76個克?。?2.73%）缺乏明顯的微衛(wèi)星序列，65個克隆為雷同序列（10.89%），因此本實驗共得到469條含有串聯(lián)重復(fù)序列的
5、獨立克隆，此次FIASCO法的富集效率為78.56%。2.對上述篩選的微衛(wèi)星序列進行了特征分析。在469條單一序列中分析得到597個微衛(wèi)星位點。其中完美型為309個，占51.76%；非完美型為207個，占34.67%；復(fù)合型81個，占13.57%。所得到的微衛(wèi)星DNA核心序列的重復(fù)次數(shù)在3～96次之間，平均重復(fù)數(shù)為13.39次，重復(fù)次數(shù)主要集中在3～19次，占78.02%；所篩大菱鲆微衛(wèi)星DNA重復(fù)類型最多是二堿基，占85.25%；重復(fù)單元類別最多的是(CA/GT)n，占77.6%，其次是(AG/CT)n
6、，占11.50%。所篩微衛(wèi)星序列長度主要集中在150bp～349bp之間（81.3%）。此外，還有1個克隆含有重復(fù)單元為八堿基(AGACGGAC)n的串聯(lián)重復(fù)序列，即小衛(wèi)星序列，另兩個克隆分別含有(AC)6(GC(AC)3)6和(TG)14(AGCGCA(TG)5)4重復(fù)序列。3.開發(fā)大菱鲆微衛(wèi)星引物。分析得到的469個微衛(wèi)星位點側(cè)翼序列情況，有384個位點（81.88%）兩端有合適的側(cè)翼序列進行引物開發(fā)；結(jié)合實際情況共設(shè)計了413對引物，其中有360對能夠得到穩(wěn)定表達的產(chǎn)物。經(jīng)微衛(wèi)星標記初篩試驗，168
7、對引物（46.7%）的擴增產(chǎn)物帶型單一，183對引物（50.8%）的PCR產(chǎn)物有多態(tài)性，其中110個微衛(wèi)星位點（30.6%）符合遺傳連鎖圖譜作圖標準。4.進行大菱鲆微衛(wèi)星標記初篩實驗，以期獲得構(gòu)建大菱鲆遺傳連鎖圖譜的作圖標記。通過擬作圖家系的2個親本和6個Fl代個體對748對微衛(wèi)星引物（上述實驗開發(fā)的360對引物和文獻已發(fā)表的388對引物）進行初步篩選，1上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文其中有721對引物能夠獲得清晰的擴增產(chǎn)物：254對引物的擴增產(chǎn)物為單一目的條帶；467對引物擴增產(chǎn)物的目的條帶具有多態(tài)性，其中有
8、294個微衛(wèi)星位點符合遺傳圖譜作圖標記的標準。5.微衛(wèi)星標記在作圖家系F1代中的分離模式。從初篩試驗獲得的294個符合作圖標準的微衛(wèi)星位點中，隨機選取120對微衛(wèi)星引物，在擬作圖家系的2個親本和92個Fl代個體中進行標記分離情況研究，其中115對引物能夠獲得清晰的擴增產(chǎn)物。共得到五種分離模式（♀×♂）：abxcd、efxeg、hkxhk、lmxll、nnxnp；每個標記分離產(chǎn)生2~4個等位基因，共獲得254個等位基因，平均等位
