細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)

《細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。

1、細(xì)胞培養(yǎng)CellCulture2第四章細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)4.1基本操作技術(shù)和要求3培養(yǎng)前準(zhǔn)備制訂試驗計劃和操作程序準(zhǔn)備各種器材物品培養(yǎng)室和超凈臺的消毒0.2%新潔爾滅托洗地面紫外燈照射30-60分鐘以75%乙醇擦拭無菌操作臺面培養(yǎng)室內(nèi)的無菌操作4洗手和著裝徹底洗手以75%乙醇消毒手和前臂可穿經(jīng)紫外線照射30min的一般清潔工作服。無菌培養(yǎng)操作一切操作都應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過灼燒進(jìn)行。小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上

2、放置桌面。培養(yǎng)室內(nèi)的無菌操作5678910無菌操作中常犯的錯誤吸管、剪刀等碰到其他器皿11無菌操作中常犯的錯誤正確的拿管姿勢錯誤的拿管姿勢拿吸管時手碰到無菌區(qū)！12無菌操作中常犯的錯誤培養(yǎng)基浸濕吸管底部的棉花134.2原代培養(yǎng)14將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。如系組織塊培養(yǎng)，則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個小時后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基。如系細(xì)胞培養(yǎng)，一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細(xì)胞數(shù)表示）接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞盡早進(jìn)入生長狀態(tài)。細(xì)胞

3、和組織培養(yǎng)15計數(shù)細(xì)胞細(xì)胞數(shù)/ml=計數(shù)16格×稀釋倍數(shù)×10416原理：（1）計算細(xì)胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是Coultercounter粒子計數(shù)器自動計數(shù)。（2）血球計數(shù)盤一般有二個chambers，每個chamber中細(xì)刻9個1mm2大正方形，其中4個角落之正方形再細(xì)刻16個小格，深度均為0.1mm。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用時，計數(shù)每個大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細(xì)胞數(shù)目。（3）存活測試之步驟為dyeexclusion（染料排除），利用染

4、料會滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍(lán)色之trypanblue染料，如果細(xì)胞不易吸收trypanblue，則用紅色之Erythrosinbluish。計算細(xì)胞活率：活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）×100%。計數(shù)應(yīng)在臺盼蘭染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成，隨時間延長，部分活細(xì)胞也開始攝取染料；因為臺盼蘭對蛋白質(zhì)有很強的親和力，用不含血清的稀釋液，可以使染色計數(shù)更為準(zhǔn)確。17兩個概念原代培養(yǎng)直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞、組織和器官進(jìn)行的第一次的培養(yǎng)物。一旦已進(jìn)行傳代培養(yǎng)（Subculture）的細(xì)胞，便不再稱為原代培養(yǎng)，而改稱為細(xì)胞系。

5、傳代培養(yǎng)細(xì)胞長滿瓶底后要進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將一瓶中的細(xì)胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱為“一代”。二倍體細(xì)胞一般只能傳幾十代，而轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或細(xì)胞株則可無限地傳代下去。18培養(yǎng)細(xì)胞的取材理論上講各種動物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng)，實際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。19組織塊培養(yǎng)法新鮮取材的組織中細(xì)胞仍具有分裂增殖的能力。將組織切成小塊培養(yǎng)在模擬體內(nèi)的環(huán)境中，小塊組織的細(xì)胞可以游離出來，從培養(yǎng)液中吸取營養(yǎng)，繼續(xù)分裂生長。組織塊培養(yǎng)法適用范圍廣，常用于肝臟、

6、皮膚、角膜、骨骼、韌帶、血管、神經(jīng)、心臟等器官和組織的培養(yǎng)。5820212223242526培養(yǎng)要點材料新鮮嚴(yán)格無菌操作剔除脂肪等附著組織組織塊剪?。ㄖ睆僵?mm）擺放開（間距﹥5mm）27常犯的錯誤操作中不換器械沖洗次數(shù)不夠組織碎片太大組織塊擺放太密培養(yǎng)液加入太多28消化培養(yǎng)法消化培養(yǎng)法所用的酶有多種，目前應(yīng)用最廣的是胰蛋白酶。它是一種內(nèi)切酶，可專一水解有精胺酸或賴氨酸的羧基形成的肽鍵。從而消除妨礙細(xì)胞生長的細(xì)胞間質(zhì)，包括基質(zhì)、纖維等，使細(xì)胞分散，易于貼壁并從外界吸收養(yǎng)分和排除代謝物消化法適用于組織量大的原代培養(yǎng)。胰蛋白酶液適用于消化間質(zhì)少的組織，如羊

7、膜、胚胎、上皮、肝和腎等組織及傳代細(xì)胞。592955切成1--2mm3小塊20--60min30313233343536培養(yǎng)要點36合適的胰蛋白酶濃度（通常為0.25%）合適的消化時間：消化時，待組織塊變得較疏松，顏色略白為止（通常為37℃，20-40分鐘）37常犯的錯誤水浴鍋未預(yù)熱組織塊太大38胰蛋白酶消化不足或過度吹打用力過重常犯的錯誤394.3傳代培養(yǎng)和細(xì)胞系的維持40傳代細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞在原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的操作叫傳代。為獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株，或大量的同種細(xì)胞，當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞形成致密的單層后需進(jìn)行傳代培養(yǎng)。6341首次傳代注意事項細(xì)胞沒有生長

8、到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前（80%），不要急于傳代。傳代時不同的細(xì)胞有不同