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1、附件豬用生物制品及相關(guān)豬源原輔材料中非洲豬瘟病毒核酸檢測方法1適用范圍1.1豬用及采用豬源原輔材料制備的生物制品成品及半成品。1.2豬源毒種。1.3豬源細胞及相關(guān)制品生產(chǎn)用細胞。1.4其他豬源原輔材料（如組織、血清、胰酶衍生物等）。2取樣和處理2.1疫苗2.1.1活疫苗取至少2瓶樣品，按瓶簽注明頭份用適宜稀釋液分別稀釋成10頭份/0.2ml，等量混合，取混合液進行核酸提取。2.1.2滅活疫苗取至少2瓶樣品，等量混合后進行以下處理。2.1.2.1油佐劑滅活疫苗取36ml混合疫苗，加入正戊醇4.0ml，充分振蕩混合1分鐘，2～8℃冰箱靜置不少于60分鐘，直至油相和水相分離。取
2、水相進行核酸提取。2.1.2.2水性佐劑滅活疫苗2.1.2.2.1鋁膠佐劑滅活疫苗取混合疫苗5.0ml，搖勻，加入0.25g解離劑CPG-odn（人工合成的寡聚核苷酸），放入搖床（200r/min）37℃解離1小時，5000r/min離心10分鐘，取上清液進行核酸提取。2.1.2.2.2其他水性佐劑滅活疫苗直接取混合樣品進行核酸提取。2.2其他生物制品和半成品凍干類制品，按活疫苗進行取樣和處理；液體制品及半成品，取至少2份（瓶）樣品，等量混合，取混合液進行核酸提取。2.3豬源毒種取至少2支毒種。凍干毒種，按凍干前體積復(fù)溶后等量混合，取混合液進行核酸提?。环莾龈啥痉N，等量混
3、合后直接取混合液進行核酸提取。2.4豬源細胞除另有規(guī)定外，取至少2瓶細胞濃度不少于107.0個細胞/ml的細胞懸液進行核酸提取。2.5其他豬源原輔材料2.5.1豬組織每種組織，分別取樣和處理。取不少于2.0g組織，研磨后用5倍體積滅菌PBS懸浮，70℃滅活30分鐘，4℃下以2000～3000g離心10分鐘，取上清液進行核酸提取。2.5.2豬血清每批血清取至少2個最小包裝的樣品，等量混合，取混合液進行核酸提取。2.5.3豬胰酶干粉狀胰酶，取至少2份樣品，根據(jù)使用情況分別配制成不低于2.5%濃度的溶液，等量混合，取混合液進行核酸提?。灰后w胰酶，取至少2個最小包裝的樣品，等量混
4、合，取混合液進行核酸提取。2.5.4其他豬源衍生物固體、液體或干粉狀豬源衍生物，可分別按組織、血清或干粉狀胰酶的方法進行取樣和樣品處理。3核酸提取3.1試劑和器材3.1.1試劑根據(jù)核酸提取方法確定，如氯仿、異丙醇、無水乙醇、0.1mol/l檸檬酸鈉（含10%乙醇）、75%乙醇等。3.1.2儀器核酸含量測定儀；常溫臺式離心機；旋渦振蕩器；水浴鍋；微量移液器1套（最大量程分別為10μl、100μl、200μl、1000μl）。3.1.3耗材1.5ml帶蓋離心管、無菌吸頭（0～10μl、0～200μl、100～1000μl）、一次性乳膠手套。3.2操作程序（TRIZOL法），也
5、可以選擇其他等效核酸提取方法提取樣品中的DNA。3.2.1取樣品250μl，加入750μlTrizol，顛倒混勻，室溫放置5分鐘。3.2.2加入200μl氯仿，充分混勻，室溫放置10分鐘，4℃下以12000g離心15分鐘。3.2.3棄去上清液，加入220μl無水乙醇，顛倒混合，15～30℃放置2～3分鐘，2～8℃以2000g離心5分鐘，沉淀物為DNA。3.2.4棄去上清液，加入含10%乙醇的0.1mol/l檸檬酸鈉750μl洗滌DNA，15～30℃放置30分鐘，2～8℃以2000g離心5分鐘。重復(fù)一次。3.2.5加入75%乙醇1.2ml，重懸DNA沉淀，15～30℃放置2
6、0分鐘，4℃2000g離心5分鐘?？芍貜?fù)一次，充分洗滌DNA沉淀。3.2.6棄去上清液，敞開離心管管口，在空氣中干燥5～10分鐘，加入30～50μl的無核酸酶滅菌水溶解DNA，－20℃以下保存?zhèn)溆谩?.3注意事項3.3.1核酸提取試劑具有腐蝕和強變性能力，應(yīng)做好個人防護，佩戴手套、口罩和護目鏡，防止液體飛濺到皮膚和眼睛。3.3.2后續(xù)的核酸檢測敏感性很高，要防止樣品之間相互污染，最好使用帶濾芯的槍頭，且每次吸取取液體時均需更換槍頭。3.3.3為防止核苷酸降解，應(yīng)避免核酸酶污染，使用的耗材均需無核酸酶。3.3.4做好剩余樣品的無害化處理及操作臺面的消毒處理。剩余樣品可通過高
7、壓滅菌或煮沸處理，也可放在1%衛(wèi)可或2%氫氧化鈉消毒液中浸泡處理，操作臺面使用1%衛(wèi)可擦拭。3.3.5提取后的DNA樣品要用錫箔紙封存，取樣時應(yīng)用槍頭直接刺破錫箔紙取樣，防止污染。4檢測下列兩種方法可任選其一。4.1實時熒光定量PCR檢測法4.1.1試劑和器材4.1.1.1試劑4.1.1.1.1熒光定量PCR試劑本操作中以AppliedBiosystemsTaqManGeneExpressionAssayskit為例，也可選用其他熒光定量PCR試劑。4.1.1.1.2擴增引物及探針擴增引物：ASF-05-Zsak-1466F（
