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1、總糖和還原糖的測定（3,5—二硝基水楊酸法）實驗報告前言糖在我們?nèi)粘Ｉ钪须S處可見，我們吃的米飯、水果、零食中或多或少都含有一些糖類。同時，糖也是我們維持機體運動所必不可少的物質(zhì)，沒有了它，就沒有了能量的來源。我們這次便走進實驗室探索糖類的奧秘。本次實驗我們將用3,5—二硝基水楊酸法測定總糖和還原糖中的含糖量。本次實驗中，我們除了要掌握還原糖和總糖的測定基本原理還要學(xué)習(xí)比色法測定還原糖的操作方法以及分光度法測定的原理和方法。首先，讓我們一起來了解一下它們的測定方法吧。還原糖的測定是糖定量測定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖
2、，雙糖和多糖不一定是還原糖，其中乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。利用糖的溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來，對沒有還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進行測定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄糖含量計）。還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系，利用分光光度計，在540nm波長下測定光密度值，查對標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為
3、單糖時，每斷裂一個糖苷鍵需加入一分子水，所以在計算多糖含量時應(yīng)乘以0.9。一、實驗?zāi)康?、掌握還原糖和總糖的測定的基本原理2、學(xué)習(xí)比色法測定還原糖的操作方法3、學(xué)習(xí)分光光度法測定的原理和方法二、實驗原理 還原糖的測定是糖定量測定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，其中乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。利用糖的溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來，對沒有還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進行測定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄糖含量
4、計）。還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系，利用分光光度計，在540nm波長下測定光密度值，查對標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時，每斷裂一個糖苷鍵需加入一分子水，所以在計算多糖含量時應(yīng)乘以0.9。三、材料與器具的準(zhǔn)備。實驗材料：面粉。實驗試劑（1）、1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 準(zhǔn)確稱取80℃烘至恒重的分析純葡萄糖100mg，置于小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，用
5、蒸餾水定容至100mL，混勻，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＃?）、3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑 將6.3gDNS和262mL2MNaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1000mL，貯于棕色瓶中備用。（3）、碘-碘化鉀溶液：稱取5g碘和10g碘化鉀，溶于100mL蒸餾水中。（4）、酚酞指示劑：稱取0.1g酚酞，溶于250mL70%乙醇中。（5）、6MHCl和6MNaOH各100mL。實驗器材（1）具塞玻璃刻度試管：20mL×11（2）大離心管：50mL×2（3）燒杯：
6、100mL×1（4）三角瓶：100mL×1（5）容量瓶：100mL×3（6）刻度吸管：1mL×1；2mL×2；10mL×1（7）恒溫水浴鍋（8）沸水?。?）分光光度計分光光度計的基本原理是溶液中的物質(zhì)在光的照射下，產(chǎn)生了對光吸收的效應(yīng)，物質(zhì)對光的吸收是具有選擇性的。各種不同的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜，因此當(dāng)某單色光通過溶液時，其能量就會被吸收而減弱，光能量減弱的程度和物質(zhì)的濃度有一定的比例關(guān)系，也即符合比色原理——Lambert-Beer'slaw:數(shù)學(xué)表達式:A=lg(1/T)=KCLA為吸光度T為透射率,是投射光強度比上入射光強度C為吸光物質(zhì)的濃
7、度L為吸收層厚度K為吸收系數(shù)物理意義是當(dāng)一束平行單色光垂直通過某一均勻非散射的西光物質(zhì)時,其吸光度A與吸光物質(zhì)的濃度C及吸收層厚度L成正比.四、實驗步驟。器材與材料準(zhǔn)備完畢之后，便開始按照以下步驟進行實驗。首先，制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。取6支20mL具塞刻度試管編號，按下表分別加入濃度為1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、蒸餾水和3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑，配成不同葡萄糖含量的反應(yīng)液。管號試劑012345標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液ml00.20.40.60.81.0蒸餾水ml2.01.81.61.41.21.0DNS試劑ml1.51.51.51.51.51.5接
8、下來，提取還原糖。準(zhǔn)確稱取2.00g食用面粉，放入100mL燒杯中，先用少量蒸餾水調(diào)成糊狀，然
