細(xì)胞培養(yǎng)第四章 細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù).doc

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1、第四章細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)第一節(jié)基本操作技術(shù)和要求r1培養(yǎng)室內(nèi)的無菌操作內(nèi)謂2培養(yǎng)細(xì)胞的取材匚3各類組織的取材技術(shù)1*培養(yǎng)室內(nèi)的無菌操作1.1*培養(yǎng)前準(zhǔn)備：實驗前要制定好實驗計劃和操作程序,有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好1」」根據(jù)實驗要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品;1.1.2清點無誤后將各種所需器材和物品放置操作場所（培養(yǎng)室、超凈臺）內(nèi);可避免開始實驗后，因物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會。1.2*培養(yǎng)室和超凈工作臺的消毒：1.2.P無菌培養(yǎng)室：⑴每天都要用0.2%的新潔爾滅或2%?5%來蘇爾拖地面一次（拖布要專用）；（2）紫外線

2、照射消毒30?50min。1.2.2*超凈工作臺：臺面每次實驗前要用75%酒精擦洗，然后紫外線消毒30min。1.2.3*注意：⑴在工作臺而消毒時切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時照射紫外線；（2）消毒吋工作臺面JL用品不要過多或重疊放置，否則會遮擋射線，降低消毒效果；（3）一些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內(nèi)同吋紫外線照射消毒。]?3*洗手和著裝.1.3.1原則上須徹底洗手并按外科手術(shù)要求著裝;1.3.2無菌服、帽子和口罩每次實驗后都要清洗消毒；1.3.3開始操作前要用75%酒精或0.2

3、%新潔爾滅消毒手和前臂。1.3.3*注意：⑴如果實驗過程屮手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手；⑵平時僅做觀察不做培養(yǎng)操作時，可穿經(jīng)紫外線照射30min的一般清潔工作服；（3）培養(yǎng)室外最好準(zhǔn)備好幾套以上的工作服，便于隨時進(jìn)入培養(yǎng)室穿用。1?護(hù)無菌培養(yǎng)操作：1.4.1在實驗前，要點燃酒精燈或煤氣燈，一切操作如安裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。1.4.2宕注意：（1）金展器械不能在火焰屮長時間燒灼，以防退火；（2）燒過的器械要冷卻后才能使用，如銀子應(yīng)冷卻后才能夾取組織，否則可能造成

4、組織細(xì)胞損傷；（3）已吸過培養(yǎng)液的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管內(nèi)的培養(yǎng)液如蛋白質(zhì)等燒焦后會產(chǎn)生有害物質(zhì)，吸管再用吋會將其帶到培養(yǎng)基屮；（4）開啟和關(guān)閉有細(xì)胞生長的培養(yǎng)瓶吋，火焰滅菌時間要短，防止因溫度過高燒死細(xì)胞（5）膠塞、橡皮乳頭及塑料的細(xì)胞培養(yǎng)用品過火焰時也不能時間過長，以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體，危害培養(yǎng)細(xì)胞，塑料細(xì)胞培養(yǎng)用品會產(chǎn)生變形影響使用。（6）工作臺面上的用品要放置有序、布局合理，例如：酒精燈在屮間，右手使用的物品在右側(cè)，左手用品在左側(cè)；（7）工作吋忌忙亂血要有順序；（8）組織、細(xì)胞及培養(yǎng)板在未做處理和使

5、用前，不要過早暴露于空氣屮；R]34C二二「⑥圖5-1培養(yǎng)用品布局1酒精燈7緩沖液2廢液缸8培養(yǎng)瓶架3培養(yǎng)液架9培養(yǎng)瓶4吸管架10吸管5后備品U瓶帽6培養(yǎng)液(9)應(yīng)分別使用不同吸管吸取營養(yǎng)液、PBS、細(xì)胞懸液及其他各種用液而不能混HL(10)用吸管、注射器進(jìn)行轉(zhuǎn)移液體操作時，吸管、注射器針頭、不能觸及瓶口以防止細(xì)菌污染或細(xì)胞的交叉污染；(11)培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)液瓶不要過早打開，已開口者要盡量避免垂直放置以防止下落細(xì)菌的污染；(12)放置吸管時管口向下傾斜，以防液體倒流入橡皮乳頭內(nèi)引起污染。(13)進(jìn)行培養(yǎng)操作時，不要用手觸

6、及已消毒的器皿，如己接觸，要用火焰燒灼或取備用品更換；(14)而向操作野時勿大聲講話或咳嗽，以免噴出的唾沫把細(xì)菌等帶入工作臺面發(fā)生污染。2培養(yǎng)細(xì)胞的取材人和動物細(xì)胞的取材是原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的首要條件，是進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的第一步。2.1*取材的基本要求2.1.P取材要注意新鮮和盡快培養(yǎng)：新鮮組易于培養(yǎng)成功(1)取材吋應(yīng)盡量在4?6h內(nèi)能制作成細(xì)胞，盡快入箱培養(yǎng)；⑵若不能即時培養(yǎng)，應(yīng)將組織浸泡于培養(yǎng)液內(nèi)，于4°C存放;(3)若組織塊較大，應(yīng)在清除表面血塊、壞死組織、脂肪和結(jié)締組織后，切碎于培養(yǎng)液內(nèi)4°C存放，但時間不能超過24

7、h;⑷對于已切碎的組織或血液、淋巴組織應(yīng)加入含10%二甲基亞硯的培養(yǎng)基，按細(xì)胞凍存方式于液氮屮冷凍保存。2.1.2*取材應(yīng)嚴(yán)格無菌：(1)用無菌包裝的器U1L或事先消毒好的、帶少許培養(yǎng)液(內(nèi)含400單位/mL抗菌素)的小瓶等便于攜帶的物品來取材；(2)所取材料應(yīng)盡量避免紫外線照射和接觸有毒有害的化學(xué)物質(zhì)，如碘、汞等。(3)對所取材料若疑有污染的可能(如從消化道、周圍有壞死組織等)，應(yīng)將所取組織在含青、鏈霉素(500-1000U/mL)PBS液漂洗5-10min或10%達(dá)克寧注射液沖洗浸泡lOmin后，再培養(yǎng)。(4)取材

8、和原代細(xì)胞制作吋，要用鋒利的器械，如手術(shù)刀或剃須刀片切碎組織，盡可能減少對細(xì)胞的機(jī)械損傷；(5)要仔細(xì)去除所取材料上的血液(血塊)、脂肪、壞死組織及結(jié)締組織，切碎組織吋應(yīng)避免組織干燥，可在含少量培養(yǎng)液的器皿屮進(jìn)行；(6)原代培養(yǎng)，特別是正常細(xì)胞的培養(yǎng)，應(yīng)采用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)液，最好添加胎牛血清。含量為：10%?20%；(7)取材應(yīng)注