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1、無菌操作基本技術(shù)1.實驗進行前，無菌室及無菌操作臺(laminarflow)以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以70%ethanol擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運轉(zhuǎn)10分鐘后,才開始實驗操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70%ethanol擦拭無菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺運轉(zhuǎn)10分鐘以上后，再進行下一個細(xì)胞株之操作。2.無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時
2、放置，其它實驗用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70%ethanol擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實驗操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。3.小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45。角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌而。1.工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃壷疅o菌操作臺（至少ClassII）o
3、操作過程中，應(yīng)避免引起aerosol之產(chǎn)生，小心毒性藥品,例如DMSO及TPA等，并避免尖銳針頭之傷害等。2.定期檢測下列項目：2.1.C02鋼瓶之C02壓力2.2.C02培養(yǎng)箱之C02濃度、溫度、及水盤是否有污染（水盤的水用無菌水，每周更換）。2.3.無菌操作臺內(nèi)之a(chǎn)irflow壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)（300小時/預(yù)濾網(wǎng)，3000小時/HEPA）o3.水槽可添加消毒劑（Zephrin1:750）,定期更換水槽的水。實驗用品3.3.5.種類：4.1.5.細(xì)胞培養(yǎng)實驗用品均為無菌，除了玻
4、璃容器與pasteurpipet夕卜,其它均為塑料無菌制品。4.1.5.TC級培養(yǎng)盤表而均有coating高分子物質(zhì)以讓細(xì)胞吸附/培養(yǎng)容器種類有Tflask,plates,dishes,rollerbottle等，依實驗需耍使用。4.1.5.plasticsterilepipet:1ml,2ml,5ml,10ml,25ml4.1.5.塑料離心管：15ml,50ml,均有2種不同材質(zhì)，其中polypropylene（PP）為不透明材質(zhì)，polystyrene(PS)為透明材質(zhì)，可依實驗需要而選擇適合材質(zhì)之離心管。
5、4.1.5.glasspastuerpipet:9inch,用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。7.3.玻璃血清瓶(PyrexorDuranglassware)：100ml,250ml,500ml,1000ml3.3.6.清洗：4.1.6.新購玻璃血清瓶先以0.1-0.05NHCI浸泡數(shù)小時，洗凈后才開始使用。4.1.6.用過之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。3.3.7.滅菌：4.1.7.實騎用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121oC,15lb,20分鐘，置于ov
6、en中烘干。4.1.7.實驗用玻璃pasteurpipet以干熱滅菌170oC,4小時。4.1.7.液體或是固體廢棄物可用10%hypochloride溶液(次氯酸，即漂白水)或是蒸汽高壓滅菌121oC,15lb,20分鐘。培養(yǎng)基1.液體培養(yǎng)基貯存于4oC冰箱，避免光照，實驗進行前放在37oC水槽中溫?zé)帷?.液體培養(yǎng)基(加血清)存放期為六個月，期間glutamine可能會分解，若細(xì)胞生長不佳，可以再添加適量glutamineo3.粉末培養(yǎng)基配制(以1升為例)：3.細(xì)胞培養(yǎng)基通常須添加10%血清，因此粉末培養(yǎng)基之
7、配制體積為900ml,pH為7.2-7.4oNaHCO3為另外添加，若將NaHCO3粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會造成pH之誤差，或局部過堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3粉末應(yīng)分別溶解后才混合，然后用C02氣體調(diào)整pH,而非用強酸(HCI)或強堿(NaOH),因為氯離子對細(xì)胞生長可能有影響，且貯存時培養(yǎng)基的pH易發(fā)生改變。3.材料：3.2.純水(milli-Q水或二次至三次蒸憎水，水品質(zhì)非常重要)3.2.粉末培養(yǎng)基3.2.NaHCO3(SigmaS-4019)3.2A電磁攪拌器2...無菌血清瓶3...0.1或0.
8、2mm無菌過濾膜4...pHmeter5...真空幫浦6...C02氣體1.步驟：1.1.取粉末培養(yǎng)基溶于700mlmilli-Q水中，攪拌使其溶解。1.1.稱取適量之NaHCO3粉末(數(shù)量依培養(yǎng)基種類而異，表一)溶于200mlmilli-Q水中，攪拌使其溶解，然后通入CO2氣體至飽和，約3?5分鐘。1.1.將溶解且含飽和CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合?；旌笕芤褐畃
