分子克隆技術(shù).doc

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1、實(shí)驗(yàn)操作手冊2005生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院課程簡介分子克隆技術(shù)是指DYA的無性繁殖技術(shù)。分子克隆技術(shù)課程主要是針對生物技術(shù)專業(yè)、生物科學(xué)專業(yè)、生命科學(xué)與技術(shù)基地班本科生及生物學(xué)類專業(yè)研究生而開設(shè)的實(shí)驗(yàn)課。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容涉及分子克隆的一些基本方法及基本操作技巧，主要包括分子克隆和分子雜交兩大部分：分子克隆技術(shù)：。"重組技術(shù)是分子生物學(xué)的核心內(nèi)容。本實(shí)驗(yàn)利用質(zhì)粒載體克隆外源DNA片段，通過這個(gè)實(shí)驗(yàn)大家可以掌握質(zhì)粒載體的抽提、外源DNA的準(zhǔn)備、酶切、連接及感受態(tài)細(xì)胞的制備、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化以及陽性克隆子的鑒定和驗(yàn)證

2、等。分子雜交技術(shù)：實(shí)驗(yàn)室常用的分子雜交技術(shù)主要有Southernblotting,Northernblotting,Westernblotting及Dotblotting等。Southernblotting是通過用一種或多種限制性內(nèi)切酶消化基因組或其它來源的DNA,經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳按大小分離酶切所得的片段，隨后DNA在原位發(fā)生變性并從凝膠轉(zhuǎn)移到一固和支持物上（硝酸纖維素膜或尼龍膜）。DNA轉(zhuǎn)移至同相支持物的過程屮各DM的相對位置保持不變，用一定方法（如放射性同位素）標(biāo)記的DNA探針與固著在膜上的

3、DNA雜交，經(jīng)X-光片自顯影顯現(xiàn)出與探針DNA互補(bǔ)的DNA電泳條帶的位置，然后進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)要求掌握植物總DNA的抽提、質(zhì)量檢測、限制性內(nèi)切酶操作、DNA的瓊脂糖凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、探針的制備、同位素操作等方面的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。在轉(zhuǎn)錄水平上研究和了解基因的表達(dá)與調(diào)控是分子生物學(xué)和基因操作的重要內(nèi)容。為讓學(xué)生初步了解有關(guān)RNA的操作過程注意事項(xiàng)，我們還列出Northernblotting的操作步驟以供選擇。系歹U一分子克隆技術(shù)4實(shí)驗(yàn)一質(zhì)粒的制備4實(shí)驗(yàn)二DNA的瓊脂糖凝膠電泳5實(shí)驗(yàn)三外源DNA片段在質(zhì)粒載體中

4、的克隆7實(shí)驗(yàn)四感受態(tài)細(xì)胞的制備9CaC12感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)步驟9電轉(zhuǎn)化法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)步驟10實(shí)驗(yàn)五質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的鑒定11熱激法轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟：11質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞操作步驟12實(shí)驗(yàn)六PCR技術(shù)12系歹I匚Southern雜交技術(shù)14實(shí)驗(yàn)一植物總DNA的快速少量抽提(CTAB法)14實(shí)驗(yàn)二總DNA質(zhì)量檢測及酶切15實(shí)驗(yàn)三電泳、轉(zhuǎn)膜16實(shí)驗(yàn)四SouthernBlottingis系列三NorthernBlotting24實(shí)驗(yàn)一RNAExtraction(miniprep

5、)24實(shí)驗(yàn)二RT-PCR(ReversetranscriptionPCR)26實(shí)驗(yàn)三RNA的電泳，轉(zhuǎn)膜和雜交28附錄試劑配方29一細(xì)菌培養(yǎng)試劑30二質(zhì)粒抽提試齊U30%1DNA操作試齊I」31%1RNA操作試劑34StockSolution:34WorkSolution35系列一分子克隆技術(shù)實(shí)驗(yàn)1質(zhì)粒的制備質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌屮擴(kuò)增或表達(dá)的主要載體，它在基因操作屮具有重要作用。質(zhì)粒的分離與提取是最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。質(zhì)粒的提取方法很多，大多包插3個(gè)主要步驟：細(xì)菌的培養(yǎng)、細(xì)菌的收集和裂解、

6、質(zhì)粒DNA的分離和純化。本實(shí)驗(yàn)以堿裂解法為例，介紹質(zhì)粒的抽提過程。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆諌A裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用。實(shí)驗(yàn)材料：含有質(zhì)粒pUC18載體的大腸桿菌菌液，克隆有水稻外源片段的BAC的大腸桿菌菌液。實(shí)驗(yàn)原理：在pH12.0?12.6堿性環(huán)境屮，細(xì)菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。將pH調(diào)至屮性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色休DNA、大分子量的RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過

7、離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清屮，然后用酚、氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。實(shí)驗(yàn)步驟：1.取含有pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌菌液于LA培養(yǎng)基上37°C過夜培養(yǎng)；2.用無菌牙簽挑取單菌落，接種于含有Amp抗生素的LB培養(yǎng)基屮，37°C搖床?250r/min過夜培養(yǎng)；3.吸取1.5ml菌液,12000g離心2分鐘，收集菌體，倒掉菌液;吸取1.5ml菌液,再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈；4.加入300山溶液I振蕩打勻，重新懸浮細(xì)胞，震蕩混勻（注意：應(yīng)徹底打勻沉淀或

8、碎塊）；5.加入300pl溶液H,輕柔顛倒混勻，放置至清亮，一般不超過5分鐘；6.加入300』溶液顛倒混勻，放置于冰上10分鐘，使雜質(zhì)充分沉淀；7.12000g離心10分鐘；1.吸取800卩1上清液（注意：不要吸取到飄浮的雜質(zhì)）至另一Eppendorf管屮，加入2/3體積的界內(nèi)醇，室溫下放置5分鐘；2.12000g常溫離心15分鐘;3.倒盡上清，加75%乙醇浸洗除鹽（放置片刻或離心3分鐘后倒去上清）；4.室溫放置或超凈臺上風(fēng)干DNA；5.加40pl滅菌超純水或TE溶解；6.質(zhì)粒、B