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1、熒光定量PCR技術(shù)檢測黑素瘤BRAF基因突變黑色素瘤概況惡性黑色素瘤(黑色素瘤)是臨床上較為常見的皮膚粘膜和色素膜惡性腫瘤，也是發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一，年增長率為3％～5％。2010年全球黑色素瘤新發(fā)病例199627例，死亡例數(shù)為46372例［1］。雖然黑色素瘤在我國發(fā)病率較低，但近年來成倍增長，每年新發(fā)病例約2萬例［1］。［1］CSCO黑色素瘤專家委員會，中國黑色素瘤診治指南(2011版)，臨床腫瘤雜志2012年2月第17卷第2期BRAF基因與黑色素瘤檢測我國468例原發(fā)黑色素瘤標(biāo)本，BRAF突變率為25,9％其中BRAFV600E是最常見的突變位點(diǎn)(
2、87％)，這為中國患者使用BRAFV600E抑制劑(Vemurafenib)提供了理論基礎(chǔ)［1］。在103個治療中心共入組了675例不能手術(shù)切除的Ⅲ期或Ⅳ期的初治黑色素瘤患者，結(jié)果Vemurafenib組的客觀有效率達(dá)到48％而達(dá)卡巴嗪(DTIC)組僅5.5％，故在指南中也將Vemurafenib作為BRAFV600E突變患者的一類證據(jù)推薦。［1］CSCO黑色素瘤專家委員會，中國黑色素瘤診治指南(2011版)臨床腫瘤雜志2012年2月第17卷第2期絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路該通路在細(xì)胞的生長、分化和增殖中起著重要作用，通路通過Ｒas、Ｒaf、有
3、絲分裂原活化蛋白激酶(MEK)及胞外信號調(diào)節(jié)激酶(EＲK)的特異性級聯(lián)磷酸化將信號由細(xì)胞外傳入細(xì)胞核內(nèi)［2］。［2］董高超，周湘，唐偉方，陸濤.B-Ｒaf激酶抑制劑的研究進(jìn)展［J］中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)2014，45(1):1－9.BRAF基因RAF激酶家族有3個亞型:ARAF、BRAF和CRAF。這3個亞型均有3個保守區(qū)域CR)：CR1、CR2和CR3。研究表明BRAFV600E的催化活性比野生型B-Ｒaf活性高500倍［3］［3］WanPTC，GarnettMJ，ＲoeSM，etal．MechanismofactivationoftheＲAF-EＲKsignal
4、ingpathwaybyoncogenicmutationsofB-ＲAF［J］．Cell，2004，116(6):855－867.ARMS引物只和突變位點(diǎn)結(jié)合，然后TaqDNA多聚酶啟動PCR反應(yīng)ARMS引物不與野生型靶DNA結(jié)合，因而TaqDNA多聚酶無法啟動PCR反應(yīng)擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)PCR原理引物與探針結(jié)合區(qū)的上游序列結(jié)合引物延伸復(fù)制的區(qū)域與探針區(qū)互補(bǔ)阻止基團(tuán)使DNA多聚酶不能復(fù)制探針區(qū)隨著溫度升高，引物延伸序列變性溫度降低，引物延伸序列內(nèi)部雜交熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)開始有熒光信號未延伸引物則退火，熒光信號被淬滅實(shí)時熒光定量PCR檢測BRAF突變步驟第一步
5、：石蠟組織切片DNA提取第二步：樣品評估第三步：樣品檢測石蠟組織中DNA提取1.石蠟組織切片收集及鑒定2.組織切片刮取3.加熱裂解消化DNA4.去除石蠟5.吸附柱收集DNA實(shí)時熒光定量PCR質(zhì)量監(jiān)控1、樣本DNA評估體系:加入5μl樣本，BRAFpositivecontrol以及無酶水（NTC）DNA樣品質(zhì)量結(jié)果分析1)NTC在FAM通道的Ct值小于40表示有污染；2)BRAFpositivecontrol(PC)在FAM通道的Ct值必須在27.82-33.85之間，如果不在這個范圍，說明設(shè)置有誤；3)在BRAFpositivecontrol和NTC都滿足要求
6、的情況下，樣本FAM通道Ct值必須在20.95-33.00之間；4)樣本FAM通道Ct值小于20.95，即使是非常接近20.95，樣本必須稀釋至Ct值在20.95-33.00之間，可以按照每稀釋兩倍Ct值增加1計(jì)算；檢測BRAF突變體系：加入待測5μl樣本，BRAFpositivecontrol以及無酶水（NTC）NTC在FAM通道的Ct值小于40表示有污染BRAFpositivecontrol(PC)在FM通道的Ct值必須在27.82-33.85之間A樣本分析mutationCt–controlCt=ΔCt檢測的意義對病理確診黑色素瘤的患者進(jìn)行BRAF突變檢
7、測對于指導(dǎo)臨床用藥十分必要。實(shí)時熒光定量PCR法（TaqMan）是目前檢測基因突變最有效的方法之一，可以在同一試管完成DNA擴(kuò)增和檢測，避免交叉污染，特異性和敏感性高。國內(nèi)開展此項(xiàng)目的部分醫(yī)院：北京大學(xué)第一醫(yī)院吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院四川大學(xué)華西醫(yī)院復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院南昌大學(xué)第二附屬院敬請批評指正!謝謝！15此課件下載可自行編輯修改，僅供參考！ 感謝您的支持，我們努力做得更好！謝謝
