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《組織細胞原位凋亡實驗.docx》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、.....................最新資料整理推薦.....................TUNEL法測凋亡操作步驟一、TUNEL檢測原理TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒是采用非同位素方法來檢測細胞在凋亡過程中DNA的斷裂情況，可在原位快速準確地檢測單個凋亡細胞。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細胞樣本（細胞涂片）的凋亡原位檢測。其原理是細胞凋亡發(fā)生時，內(nèi)源性核酸酶激活，使DNA的雙鏈斷裂或一條鏈出現(xiàn)缺口，產(chǎn)生一系列3’-OH末端，在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）作用下，組織細胞原位D
2、NA切口可被標記上生物素-dUTP，即TUNEL（TerminaldeoxynucleotidylTransferaseBiotin-dUTPNickEndLabeling），可與連接了的辣根過氧化酶的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）特異結(jié)合，在辣根過氧化酶底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）的存在下，顯示為棕色（過氧化物酶活性），特異準確地定位正在凋亡的細胞，在普通顯微鏡下即可觀察和計數(shù)凋亡細胞；由于正的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。二、試劑盒組份組份10ass
3、ays25assays儲存條件A：EquilibrationBuffer1.0mL2.5mL-20℃5.....................最新資料整理推薦.....................B：BiotinylatedNucleotideMix10μL25μL-20℃C：TdTEnzyme10μL25μL-20℃D：500×ProteinaseK10μL25μL-20℃20×SSC15mL38mL4℃E：Streptavidin-HRP10μL25μL4℃F：20×DABSubstrateBuffer5
4、0μL125μL4℃G：20×DABChromogen50μL125μL4℃H：20×HydrogenPeroxide50μL125μL4℃三、操作流程1.操作流程概覽2.細胞樣本制備準備：●PBS：8.0gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HPO4，0.24gKH2PO4，溶于800ml去離子水中，HCl調(diào)pH至7.4，加水定容至1L。●固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鮮配制；●封閉液：3%H2O2溶于甲醇；●細胞膜通透液：0.1%TritonX-100溶于PBS，新鮮配制；操作步驟：1)
5、經(jīng)過實驗處理的細胞爬片或細胞涂片，自然晾干；5.....................最新資料整理推薦.....................2)室溫固定15min~30min；PBS漂洗3×5min；3)浸入封閉液中，室溫封閉10min；PBS漂洗3×5min；4)浸入細胞膜通透液中，室溫30sec~2min；5)進行標記反應(yīng)。3.石蠟包埋組織切片預(yù)處理準備：●石蠟切片脫蠟至水：二甲苯脫蠟2×10min，梯度乙醇水合（100%、95%、90%、80%、70%）；●蛋白酶K工作液：2μL500×蛋白酶K+998
6、μLPBS；●固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鮮配制；●封閉液：3%H2O2溶于甲醇。操作步驟：1)石蠟包埋的組織切片按常規(guī)方法脫蠟至水；2)PBS漂洗3×5min；3)加入蛋白酶K工作液，37℃反應(yīng)15~30min；PBS漂洗3×5min；4)（選擇進行）室溫固定15min~30min；PBS漂洗3×5min；5)浸入封閉液中，室溫封閉10min，PBS漂洗3×5min；6)進行標記反應(yīng)。4.冰凍組織切片預(yù)處理準備：●固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鮮配制；●封閉液：3%H2O2溶
7、于甲醇；●細胞膜通透液：0.1%TritonX-100溶于PBS，新鮮配制；操作步驟：1)冰凍切片浸入固定液，室溫固定10min；PBS漂洗3×5min；2)浸入封閉液中，室溫封閉10min；PBS漂洗3×5min；5.....................最新資料整理推薦.....................3)浸入通透液中，室溫30sec~2min；4)進行標記反應(yīng)。5.陽性對照和陰性對照的準備TUNEL檢測時需要設(shè)立陽性對照和陰性對照，以顯示實驗的客觀性和準確性。1)陽性對照樣本的處理（選擇進行）DNa
8、seI反應(yīng)液（用戶自備）：（10U-3000UDNaseI；40mMTris-HClpH7.9；10mMNaCl；6mMMgCl2；10mMCaCl2）組織樣本經(jīng)過蛋白酶K處理或者通透液處理，PBS浸洗后，加入100μLDNaseI反應(yīng)液，室溫孵育10~30min，用去離子水徹底清洗玻片，浸入PBS漂洗5min，進行標記反應(yīng)。2)陰性對照樣本的處理在進行標記
