生化分析技術(shù)綜合ppt課件

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30十月20221生化分析技術(shù)綜合

130十月20222生化分析的范疇有效成分的提取和純化有效成分性質(zhì)的分析有效成分組成及結(jié)構(gòu)的分析有效成分的功能分析

230十月20223第一章生命大分子物質(zhì)的制備生命大分子物質(zhì)的特點(diǎn)：1、生命大分子是動(dòng)物、植物和微生物在進(jìn)行新陳代謝時(shí)所產(chǎn)生的活性物質(zhì)2、生命大分子的特殊性和復(fù)雜性3、生命大分子都是由簡(jiǎn)單的小分子構(gòu)成的物4、具有特殊的結(jié)構(gòu)和功能5、生命大分子不穩(wěn)定

330十月20224第一節(jié)材料的選擇與處理一、材料的選擇有效成分：欲純化的某種單一的生命大分子物質(zhì)。相對(duì)于有效成分以外的物質(zhì)稱雜質(zhì)。材料來(lái)源動(dòng)物植物根、莖、葉微生物組織、器官血液、分泌物

430十月20225選材原則：①含有效成分豐富、穩(wěn)定性好；②來(lái)源豐富、保持新鮮；③材料適合加工提??；④具有經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值。組織差異性時(shí)間差異性生理狀態(tài)差異性研究對(duì)象的選擇

530十月20226生物材料選定后，最好及時(shí)使用。如不能及時(shí)使用時(shí)，應(yīng)做好材料的處理工作以免有效成分的破壞。二、材料的處理動(dòng)物臟器冰凍干燥植物組織微生物

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930十月202210比色法葡萄糖＋O2＋H2O葡萄糖酸＋H2O2葡萄糖氧化酶H2O2＋酚＋4－AAP醌亞胺＋H2O濁度法：測(cè)定懸浮液在不被吸收的波長(zhǎng)下表觀的消光值。電化學(xué)法：測(cè)定反應(yīng)過(guò)程中H＋的濃度變化從而計(jì)算出有效成分含量。生物活性檢測(cè)免疫分析法

1030十月202211第三節(jié)細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎方法機(jī)械破碎法物理破碎法化學(xué)破碎法酶促破碎法

1130十月202212機(jī)械破碎法搗碎法研磨法勻漿法物理破碎法溫度差破碎法壓力差破碎法超聲破碎法化學(xué)破碎法利用化學(xué)滲透的方法，通過(guò)有機(jī)溶劑、抗生素、表面活性劑、金屬熬合劑、變性劑等，使細(xì)胞膜破碎的方法。酶促破碎法利用酶的活性破壞細(xì)胞膜的化學(xué)結(jié)構(gòu)使細(xì)胞膜破碎的方法。

1230十月202213第四節(jié)提取提取：在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇?處理)原料，使欲分離物質(zhì)充分溶解到溶劑中的過(guò)程稱提取，也稱抽提。提取主要是根據(jù)被分離物質(zhì)在不同溶液中的溶解度不同而實(shí)現(xiàn)提取的目的。一、抽提的含意二、影響抽提的因素1、pH值2、溶劑的極性和離子強(qiáng)度3、水解酶

1330十月2022144、溫度5、攪拌6、氧化7、金屬離子8、抽提液與抽提物的比例

14第五節(jié)濃縮沉淀法吸附法超過(guò)濾法透析法減壓蒸餾法冰凍干燥法30十月202215

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18第六節(jié)純化方案的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)30十月202219純化方案：在純化某一物質(zhì)過(guò)程中，根據(jù)被分離物質(zhì)的理化性質(zhì)、分離方法的優(yōu)劣，將幾種分離方法有機(jī)地結(jié)合并靈活應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)提取被分離物質(zhì)的技術(shù)路線，稱純化方案。

1930十月202220純化方案的設(shè)計(jì)純化方案是由幾種分離方法組成的，因此，設(shè)計(jì)純化方案時(shí)，首先要選擇分離方法。選擇分離方法的依據(jù)主要根據(jù)有效成分與雜質(zhì)間的理化性質(zhì)的差異選擇分離方法。

2030十月202221根據(jù)溶解度的差異進(jìn)行的分離根據(jù)分子大小的差異進(jìn)行的分離根據(jù)分子極性的差異進(jìn)行的分離根據(jù)分子所帶電荷的差異進(jìn)行的分離根據(jù)生物分子間特異結(jié)合性質(zhì)進(jìn)行的分離等

21第六節(jié)純化方案的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)30十月202222初分離精細(xì)分離鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法電泳法層析法離心法離子交換層析排阻層析親和層析

22第六節(jié)純化方案的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)30十月202223純化方案的評(píng)價(jià)：是對(duì)組成純化方案的每一種分離方法的評(píng)價(jià)。有效成分的含量測(cè)定比活力測(cè)定()活力單位數(shù)毫克蛋白純化倍數(shù)()每步的比活力粗提液比活力收得率(×100％)每步的總活力粗提液總活力評(píng)價(jià)指標(biāo)

2330十月202224L－門冬酰胺酶的純化步驟總蛋白/g總活力/U比活力/(U/mg)純化倍數(shù)回收率/%1粗提液30g210000.711002氧化錳處理7.64g150172.02.8723冰凍融解5.58g148722.73.8714DEAE-纖維素層析0.113g502544.563.5245硫酸銨鹽析0.048g336771.7102176羥基磷灰石0.016g3133200286157聚丙烯酰胺凝電泳0.012g310025536515

24第七節(jié)有效成分純度和性質(zhì)的分析30十月202225純度分析性質(zhì)分析比活性電泳分析高壓液相或氣相色譜免疫分析分子質(zhì)量測(cè)定分子結(jié)構(gòu)測(cè)定

2530十月202226非膜過(guò)濾膜過(guò)濾粗濾微濾(微孔過(guò)濾)常壓過(guò)濾加壓過(guò)濾減壓過(guò)濾超濾反滲透電滲析

2630十月202227利用過(guò)濾介質(zhì)而使不同大小、不同形狀的物質(zhì)彼此分離的方法稱過(guò)濾。

2730十月202228正膠束的結(jié)構(gòu)

28第二章沉淀法30十月202229一、基本原理：通過(guò)改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使某溶質(zhì)在溶液中的溶解度降低，從溶液中沉淀析出，而與其他溶質(zhì)分離的技術(shù)稱沉淀分離。第一節(jié)基本原理與沉淀類型鹽析沉淀法等電點(diǎn)沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法金屬鹽沉淀法復(fù)合沉淀法選擇性變性沉淀法

2930十月202230二、制備蛋白質(zhì)(一)鹽析法鹽溶：在低鹽濃度條件下，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的升高而增加的現(xiàn)象稱鹽溶。鹽析：在高濃度鹽溶液中，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的升高而降低的現(xiàn)象稱鹽析。

3030十月202231蛋白質(zhì)的荷電性發(fā)生了變化蛋白質(zhì)表面的水化膜發(fā)生了變化鹽的存在之所以能使蛋白質(zhì)進(jìn)行鹽溶或鹽析是因?yàn)辂}改變了溶液的離子強(qiáng)度。在離子的作用下，蛋白質(zhì)發(fā)生了如下的變化：

3130十月202232蛋白質(zhì)在溶液中的溶解度與溶液的離子強(qiáng)度的關(guān)系為：lg=-KsISS0在溫度和pH一定的條件下，S0為一常數(shù)。上式可改為：lgS=lgS0-KsI=β-KsI1、鹽析的原理

3230十月202233Ks為鹽析系數(shù)，主要決定于鹽的性質(zhì)。其大小與離子價(jià)數(shù)成正比、與離子半徑和溶液的介電常數(shù)成反比。β主要決定于蛋白質(zhì)的性質(zhì)，也與溫度和pH有關(guān)。在溫度和pH一定時(shí)，β為一常數(shù)。(1)鹽分級(jí)沉淀鹽的選擇

3330十月202234鹽的選擇在鹽析過(guò)程中選擇鹽時(shí)一般遵循以下的原則：①在水溶液中的溶解度大，能提供足夠的離子強(qiáng)度；②鹽的溫度系數(shù)要小，溫度對(duì)溶解度的影響小；③價(jià)格要便宜，減少生產(chǎn)成本。最常用的鹽是硫酸銨，此外硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等也有使用。硫酸銨濃度的調(diào)整方法飽和度是溶液中加入的飽和硫酸銨溶液的體積與混合溶液總體積之比值。

3430十月202235鹽析時(shí)的注意事項(xiàng)硫酸銨的純度要高在進(jìn)行分段鹽析時(shí)，要從低濃度到高濃度在鹽析條件相同的情況下，蛋白質(zhì)的濃度越高越容易沉淀，但也容易出現(xiàn)共沉淀，鹽析時(shí)要盡量避免共沉淀的發(fā)生鹽析產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀中含有大量的鹽，鹽析后必需將鹽除去

3530十月202236A、固體法：適用于粗提液體積比較大時(shí)蛋白質(zhì)的提取。向粗提液中直接加入硫酸銨固體顆粒，使硫酸銨達(dá)到一定濃度，而使蛋白質(zhì)沉淀的方法。硫酸銨鹽析g=533(S2-S1)100-0.3S2g=541(S2-S1)100-0.3S2（20℃）（25℃）

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3730十月202238B、飽和溶液法：利用不同飽和度硫酸銨溶液配制各種飽和度硫酸銨溶液的方法。V＝V0S2－S1S3－S2飽和硫酸銨的配制在一定量的水中加入過(guò)量的硫酸銨，加熱到50～60℃保溫?cái)?shù)分鐘，趁熱過(guò)濾，再在0℃或25℃平衡1～2天，有固體析出時(shí)即達(dá)100％飽和。

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3930十月202240C、透析法：將盛有蛋白質(zhì)溶液的透析袋放入一定濃度的大體積鹽溶液中，通過(guò)透析作用來(lái)改變蛋白質(zhì)溶液中的鹽濃度，使蛋白質(zhì)沉淀的方法。優(yōu)點(diǎn)：鹽濃度是以連續(xù)狀態(tài)變化，避免鹽濃度局部升高產(chǎn)生的不良影響缺點(diǎn)：a.透析袋容積小，處理樣品量小b.速度慢

4030十月202241(2)鹽析曲線制作

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4230十月202243分段鹽析：利用不同的離子強(qiáng)度和溶液的性質(zhì)使不同的蛋白質(zhì)分離的方法稱分段鹽析。按性質(zhì)可將分段鹽析分為：Ks分段鹽析：溫度和pH保持不變，通過(guò)改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度而使不同的蛋白質(zhì)分離的方法。β分段鹽析：溶液的離子強(qiáng)度保持不變，通過(guò)改變?nèi)芤旱臏囟然騪H值而使不同的蛋白質(zhì)分離的方法。I=1/2∑MiZi2

4330十月202244(3)鹽析的影響因子①鹽析常數(shù)(Ks)lgS=lgS0-KsM=β-KsMKs表示有效成分在特定條件下的恒定值，表示有效成分的溶解度降低的速率與鹽濃度的關(guān)系。Ks與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，也受溶液的pH、溫度鹽的種類等因素的影響。

4430十月202245②鹽分級(jí)范圍的差異性：當(dāng)分離兩種以上蛋白質(zhì)時(shí)，若每一種蛋白質(zhì)的Ks值都很大，而且鹽析范圍(鹽離子強(qiáng)度)差異明顯，則分離效果好；若Ks值很大，但鹽析范圍差異較小，則分離效果差。

4530十月202246在pH7.0溶液中幾種蛋白質(zhì)的β和Ks常數(shù)項(xiàng)目兔肌醛兔肌丙酮兔肌甘油醛兔肌乳酸兔肌磷酸甘牛血清縮酶酸激酶磷酸脫氫酶脫氫酶油醛變位酶白蛋白β常數(shù)6.3010.28.68.09.859.2Ks常數(shù)2.844.342.483.974.263.26(NH4)2SO4濃度2.202.343.342.022.322.84

4630十月202247沉淀量／mg硫酸銨飽和度／％ABC

4730十月202248③pH和鹽濃度④蛋白質(zhì)的純度和濃度(4)脫鹽2、有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑是強(qiáng)脫水劑有機(jī)溶劑是的介電常數(shù)小有機(jī)溶劑的用量V=V0×S2–S1S100-S2

4830十月202249有機(jī)溶劑沉淀法的注意事項(xiàng)(1)低溫下操作：由于有機(jī)溶劑加入水溶液時(shí)產(chǎn)生放熱反應(yīng)會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，因此必須把所用的有機(jī)溶劑預(yù)冷至－10℃，而且整個(gè)操作要在低溫下進(jìn)行。(2)中性鹽作用：加入適量的中性鹽能增加蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度，可降低有機(jī)溶劑對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用，同時(shí)還可提高分級(jí)效果。但加入的量過(guò)多，則可引起蛋白質(zhì)析出，影響有機(jī)溶劑的分級(jí)作用。中性鹽的離子強(qiáng)度可控制在<0.05。

4930十月202250(3)多價(jià)陽(yáng)離子作用：有些蛋白質(zhì)和多價(jià)陽(yáng)離子能結(jié)合形成復(fù)合物，致使蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度降低。對(duì)在高濃度溶劑中才能沉淀的蛋白質(zhì)特別有益。

5030十月2022513、等電點(diǎn)沉淀法：通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH值至某種溶質(zhì)的等電點(diǎn)，使其溶解度降低沉淀析出的方法。4、復(fù)合沉淀法：在溶液中加入某些物質(zhì)，使它與蛋白質(zhì)等形成復(fù)合物而沉淀下來(lái)的方法稱為復(fù)合沉淀法。常用的復(fù)合沉淀劑有單寧、聚乙二醇、聚丙烯酸等高分子聚合物。

5130十月2022525、金屬鹽沉淀法：利用溶液中某種溶質(zhì)與某些金屬離了反應(yīng)，生成金屬鹽沉淀，而與其他組分分離的方法，稱為金屬鹽沉淀法。6、選擇性沉淀法：利用不同蛋白質(zhì)對(duì)不同物理化學(xué)因素的穩(wěn)定性不同而實(shí)現(xiàn)對(duì)有效成分從雜質(zhì)中分離的方法。

5230十月202253脫鹽

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5430十月202255三、制備核酸核酸在生物體內(nèi)往往是與蛋白質(zhì)一起形成DNP或RNP復(fù)合物，制備核酸時(shí)首先使復(fù)合物解聚，除去復(fù)合物中蛋白質(zhì)的方法有：(1)去污劑常用的去污劑有十二烷基硫酸鈉、十二烷基肌氨酸鈉、脫氧膽酸鈉、Triton-100、吐溫-40等。

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5630十月202257(2)有機(jī)溶劑很多有機(jī)溶劑是蛋白質(zhì)變性劑，使蛋白質(zhì)變性后與核酸分開，從而提取出核酸。常用的有機(jī)溶劑變性劑有氯仿和水飽和酚。(3)蛋白水解酶：用蛋白酶處理DNP/RNP復(fù)合物中蛋白質(zhì)組分的方法比較溫和，并可避免剪切和破壞核酸。常用的蛋白酶有溶菌酶、蛋白酶K和蛋白酶E等。

5730十月2022582、多糖等雜質(zhì)的消除(1)多糖：采用動(dòng)物材料提取核酸時(shí)，宰殺前饑餓12h；植物作材料提取核酸時(shí)，置暗室培養(yǎng)數(shù)天，其體內(nèi)的糖原和淀粉可被消耗掉，有利于核酸的提取。而其它的多糖可用選擇性變性的方法沉淀除去。常用的選擇變性劑有異丙醇、十六烷基溴化銨或等體積的乙二醇甲醚處理后離心除去。

5830十月202259(2)DNA與RNA的分離①鹽濃度法：DNA與RNA在不同濃度的NaCl中的溶解度不同，可利用此性質(zhì)將兩種不同的核酸彼此分離。DNA在高濃度的鹽中溶解度大而RNA在低鹽溶液中的溶解度大。②酶水解法

5930十月2022603、核酸沉淀(1)乙醇－鹽溶液：核酸的鈉鹽或鉀鹽在多數(shù)有機(jī)溶劑中是不溶解的。在核酸溶液(濃度>0.1um/ml)中，加入0.1mol/LNaCl(含0.25mol/LNaAC或2.5mol/LNH4AC)溶液和2倍(對(duì)DNA)或2.5倍體積(對(duì)RNA)的冷無(wú)水乙醇，就可將核酸沉淀出來(lái)有機(jī)溶劑

6030十月202261(2)異丙醇：在含DNA（或大分子rRNA）的溶液中加入0.3mol/LNaAC和0.54～1倍體積的異丙醇，放置短時(shí)間后，經(jīng)離心即可得到核酸。而多糖及小分子RNA則分布于上清液中。但異丙醇沸點(diǎn)高，不易從核酸中除去，蔗糖、NaCl等在低溫下易與DNA產(chǎn)生共沉淀。

6130十月202262加聚乙二醇(PEG)-0.5mol/LNaCl溶液到核酸溶液中，可使<2kb的DNA片段溶液出來(lái)。PEG的濃度與DNA片段的分子質(zhì)量成反比。聚乙二醇