ATP通過調節(jié)AMPK信號誘導巨噬細胞炎癥小體活化和細胞焦亡

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1、暨南大學碩士學位論文題名（中英文對照）：ATP通過調節(jié)AMPK信號誘導巨噬細胞炎癥小體活化和細胞焦亡ATP-inducedinflammasomeactivationandpyroptosisisregulatedbyAMP-activatedproteinkinaseinmacrophages作者姓名：魏紅霞指導教師姓名及學位、職稱：歐陽東云博士研究員學科、專業(yè)名稱：細胞生物學學位類型：學術學位論文提交日期：2017年5月論文答辯日期:2017年6月答辯委員會主席：論文評閱人：學位授予單位和日期：

2、2017年6月29日獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得暨南大學或其他教育機構的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學位論文作者簽名：簽字日期：年月日學位論文版權使用授權書本學位論文作者完全了解暨南大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，有權保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和磁盤，允許論

3、文被查閱和借閱。本人授權暨南大學可以將學位論文的全部或部分內容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。（保密的學位論文在解密后適用本授權書）學位論文作者簽名：導師簽名：簽字日期：年月日簽字日期：年月日學位論文作者畢業(yè)后去向：工作單位：電話：通訊地址：郵編：暨南大學碩士學位論文ATP通過調節(jié)AMPK信號誘導巨噬細胞炎癥小體活化和細胞焦亡碩士研究生魏紅霞專業(yè)細胞生物學導師歐陽東云研究員暨南大學生命科學技術學院免疫生物學系摘要目的：巨噬細胞是機體抗感染最重要的固有免疫

4、細胞之一，也是聯(lián)系固有免疫和適應性免疫的紐帶。巨噬細胞通過其細胞表面或內部的特異性識別受體（PRR），識別病原相關分子模式（PAMP），從而啟動炎癥反應，并上調炎癥小體組成成分（如NLRP3、pro-caspase-1和pro-IL-1β等）的表達；如果巨噬細胞在損傷相關分子模式（DAMP）信號（即危險信號分子）的進一步刺激下，上述炎癥小體成分可組裝成具有活性的炎癥小體，釋放成熟的caspase-1和IL-1β等，或誘導細胞程序性死亡（焦亡）。細菌脂多糖（Lipopolysaccharides,LP

5、S）是革蘭氏陰性菌細胞壁的重要組分之一，位于其細胞壁的外壁層。在人體免疫系統(tǒng)對抗細菌入侵時，LPS作為PAMP被巨噬細胞的PRR所識別，而ATP是由細菌或宿主細胞在細菌感染或組織損傷的情況下釋放的危險信號分子，LPS激活的細胞在ATP的進一步刺激下，誘導炎癥小體活化，進而誘導細胞焦亡。以前有研究發(fā)現(xiàn)，ATP處理可以導致腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）的活化。AMPK是細胞能量代謝的感受器。然而，AMPK信號通路是否參與以及如何參與ATP誘導的炎癥小體活化和細胞焦亡的調控，目前尚不明確。本研究以LPS活

6、化的巨噬細胞為模型，包括小鼠巨噬細胞系J774A.1、巰基乙酸鹽（thioglycollate,TG）誘導的小鼠腹腔巨噬細胞和小鼠骨髓體外培養(yǎng)誘導的巨噬細胞（BMDM），探討胞外ATP誘導炎癥小體活化和細胞焦亡與AMPK信號通路的關系。本項目還將探討AMPK信號通路調控對細菌感染的小鼠膿毒癥模型生存率的影響，驗證該信號通路對炎癥小體活化和細胞焦亡的調控作用機制。方法：LPS處理巨噬細胞，可上調炎癥小體相關組分（包括NLRP3、pro-caspase-1、pro-IL-1β）的表達；在ATP的進一步作

7、用下，NLRP3招募凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosisassociatedspecklikeproteincontainingaCARD,ASC）（ASC因此聚集成speck），共同組裝成有活性I暨南大學碩士學位論文的炎癥小體，激活caspase-1，并將pro-IL-1β剪切加工，細胞發(fā)生焦亡，釋放成熟的IL-1β和HMGB1。因此，本論文利用多種方法檢測LPS+ATP激活炎癥小體和細胞焦亡，以及AMPK信號對上述炎癥小體和細胞焦亡的調控作用：由于發(fā)生焦亡的細胞其細胞膜上形成眾多孔隙，使細胞膜

8、失去完整性，故采用碘化丙錠（PI）染色法檢測細胞焦亡；免疫印跡法檢測細胞胞內及上清中IL-1β、HMGB1和caspase-1的表達水平，指示炎癥小體激活和細胞焦亡的發(fā)生；免疫熒光技術檢測巨噬細胞P2X7嘌呤能受體（P2X7R）以及ASC的亞細胞分布及熒光強度；CBA試劑盒（內含結合相應抗體的免疫微球）結合流式細胞術檢測細胞培養(yǎng)上清或實驗動物血清中的IL-1β表達水平；流式細胞術檢測二甲雙胍對小鼠腹腔中中性粒細胞比例的影響；利用二甲雙胍作為AMPK激動劑，或compo