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《用環(huán)磷酰胺建立小鼠疫抑制動(dòng)物模型》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、1材料與方法1.1.2主要試劑環(huán)磷酰胺、RPMI1640培養(yǎng)液(含L-谷氨酰胺，)、Hanks液(HyClone)、MTT試劑、PBS緩沖溶液(pH值7.2～7.4，HyClone)、絲裂霉素C、SA緩沖液，綿羊紅細(xì)胞，補(bǔ)體(豚鼠血清)、都氏試劑、LDH基質(zhì)液、P815細(xì)胞(購于協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心)、YAC-1細(xì)胞、FITC-Anti-CD3、PE-Anti-CD4、PerCP-Anti-CD8熒光抗體)。1.2動(dòng)物與分組Balb/C小鼠90只，雌性，6～8周齡，體重18～22g。顆粒飼料，室溫(22±2)℃，濕度60%～80%。動(dòng)物
2、在實(shí)驗(yàn)室條件下檢疫1周后，實(shí)驗(yàn)分為3項(xiàng)處理進(jìn)行，(1)處理一:測定動(dòng)物體重、脾臟重量及系數(shù);(2)處理二:測定NK細(xì)胞活性，細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性;(3)處理三:測定血清半數(shù)溶血值。每項(xiàng)處理隨機(jī)分為空白對(duì)照組、CTX-1組和CTX-2組。1.3實(shí)驗(yàn)方法和測定指標(biāo)1.3.1劑量選擇試驗(yàn)前經(jīng)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)確定CTX的LD50為240mg/kg，以1/4LD50做為本試驗(yàn)中CTX-1組的CTX劑量，即60mg/kg環(huán)磷酰胺，用蒸餾水配制，每日經(jīng)口給予。CTX-2組每日經(jīng)口給予蒸餾水，試驗(yàn)結(jié)束前一天經(jīng)腹腔注射給予動(dòng)物200mg/kg環(huán)磷酰胺［2，3］(用
3、蒸餾水配制)。另設(shè)空白對(duì)照組，蒸餾水代替受試物，每日經(jīng)口給予。動(dòng)物灌胃容積為0.3ml/10g，每周稱量體重調(diào)整灌胃量，連續(xù)灌胃4周后測定各項(xiàng)免疫指標(biāo)。1.3.2血液中T、B淋巴細(xì)胞分類計(jì)數(shù)［4］動(dòng)物處死前眼眶內(nèi)眥靜脈取血，EDTA-K2抗凝，每只設(shè)定3支流式試管進(jìn)行測定，每管加入50μl抗凝血。分別在3管中加入CD3/CD19，CD3/CD4/CD8.不同熒光素標(biāo)記的單克隆小鼠抗體。每管加入2mlFACS紅細(xì)胞裂解液，室溫下避光保存20min。1200r/min離心5min，棄去上清液。每管再加入2mlPBS，1200r/min離心5min，
4、棄去上清液。加入0.5mlPBS混勻后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。1.3.3細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活性試驗(yàn)［5，6］1.3.3.1脾細(xì)胞懸液的制備(效應(yīng)細(xì)胞)無菌取脾，用4層紗布將脾磨碎，制成單細(xì)胞懸液。用Hank＇s液洗2次，每次離心10min(1000r/min)。棄上清將細(xì)胞漿彈起，加入0.5ml滅菌水20s，裂解紅細(xì)胞后再加入5mlHank’s液，混勻后1000r/min，10min離心，用1ml含10%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/ml;加0.5ml此細(xì)胞懸液于24孔培養(yǎng)板，留一孔不加脾細(xì)胞作為對(duì)照孔。1
5、.3.3.2制備刺激細(xì)胞1000r/min，10min離心處于對(duì)數(shù)生長期的P815細(xì)胞，用5mlDMEM培養(yǎng)液懸浮P815細(xì)胞于15ml離心管中，計(jì)數(shù)細(xì)胞。加入絲裂霉素C，相當(dāng)于50μg/(2～5)×107個(gè)細(xì)胞。用錫紙包裹離心管以避光，在37℃水浴30min。用Hank’s液洗P815細(xì)胞3次，之后Hank’s液懸浮P815細(xì)胞，室溫孵育15～20min后，離心1次。將P815懸浮于培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)細(xì)胞及活性，調(diào)整終濃度為1.2×106個(gè)/ml，加0.5ml此懸液于含有脾細(xì)胞懸液的24孔(包括對(duì)照孔)板中。37℃、5%CO2孵育5天。5天期間，
6、每隔一天換一次液。1.3.3.3制備效應(yīng)細(xì)胞收集24孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)物，用Hank’s液洗1次，200r/min離心10min，收集細(xì)胞，重懸于RPMI1640培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)細(xì)胞及活性，調(diào)整細(xì)胞濃度2×107/ml。用完全培養(yǎng)液配制3個(gè)系列稀釋的細(xì)胞懸液，每個(gè)稀釋度100μl，做3個(gè)復(fù)孔。1.3.3.4制備靶細(xì)胞離心處于對(duì)數(shù)生長期的P815細(xì)胞，重懸于0.5mlHank’s液里，離心后重懸于RPMI1640完全培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/ml。1.3.3.5CTL檢測按效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞比為100∶1、50∶1、25∶1和12.5∶1(各
7、加100μl)在圓孔96孔培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中加入細(xì)胞，每孔液體總體積為200μl，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞自然釋放對(duì)照組(0.1ml靶細(xì)胞+0.1m培養(yǎng)液)和最大釋放對(duì)照組(0.1ml靶細(xì)胞+0.1ml1%NP-40液)，效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔(0.1ml效應(yīng)細(xì)胞+0.1ml培養(yǎng)液)，用96孔板水平轉(zhuǎn)頭500r/min離心5min，37℃、5%CO2培養(yǎng)4～6h。1000r/min離心5min，每孔吸取100μl上清，加于另一ELISA反應(yīng)板的孔中，每孔中加入新鮮配制的底物液50μl，室溫避光反應(yīng)30min后，每孔加入50μl終止液，終止酶促反應(yīng)。在酶聯(lián)
8、檢測儀492nm波長下讀取各孔A值，CTL活性用殺傷率表示，按如下公式計(jì)算:CTL殺傷率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔A值－靶細(xì)胞對(duì)照孔A值－效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔A值)/
